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研究背景NOTCH信号通路参与细胞的增殖、分化、凋亡,在机体发育过程中发挥着重要的作用。越来越多的研究表明:Notch信号通路在多种恶性肿瘤的发生、发展和预后中扮演重要角色,但其发挥致癌或抑癌作用通常依赖于所处的细胞环境。口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是最常见的人类恶性肿瘤之一,约占头颈部鳞状细胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,HNSCC)的90%以上,其致病机理还不清楚。最新完成的HNSCC大型队列的全基因组研究表明人Notch1基因发生高频突变,提示Notch1基因与OSCC的发生发展关系密切。番荔枝内酯(Annonaceous acetogenins,ACGs)是从番荔枝科植物中提取的一类长链脂肪酸内酯化合物,对人白血病细胞、人肝癌细胞等有很强的抑制作用,具有强效抗肿瘤活性和能逆转多药耐药等特性,使其成为国内外抗肿瘤药研究热点。但其对OSCC的作用和分子机制仍不明确。研究目的1.分析人Notch1基因在OSCC组织样本和细胞中的基因变异和表达差异。2.探讨ACGs对OSCC细胞的增殖、凋亡的影响及这些影响是否通过Notch1信号通路实现;在此基础上,上调或下调Notch1信号后,分析ACGs对OSCC细胞增值的影响,为OSCC防治提供研究基础。研究方法1.通过TCGA和USCS数据库分析人Notch1基因在OSCC中的突变、表达差异和5年病人生存率。2.从5例OSCC及其癌旁组织中提取RNA,用qRT-PCR检测人Notch1基因的表达水平;通过17例OSCC及其癌旁组织的石蜡切片完成免疫组化,分析Notch1基因的表达差异。分别提取正常口腔上皮细胞和OSCC细胞的RNA和蛋白,qRT-PCR及Western blot检测上述两类细胞系中Notch1及其相关蛋白的表达。3.通过MTT实验检测ACGs对OSCC细胞增殖的影响,流式细胞技术检测ACGs对OSCC细胞凋亡的影响,同时分析ACGs作用OSCC细胞后Notch1蛋白及其转录因子RBP-Jκ和下游目标蛋白Hes1的表达。4.采用过表达Notch1胞内段(N1ICD)和DAPT抑制Notch1信号通路,进一步验证ACGs通过Notch1信号通路影响OSCC细胞的增殖。研究结果1.TCGA和USCS数据库分析结果显示:人Notch1基因在HNSCC突变率高达20%,生存分析结果显示Notch1表达较高的病人5年生存期较长,值得关注的是大部分病人的癌组织中RBP-Jκ的表达高于癌旁组织。2.qRT-PCR结果表明:在5例OSCC病人中3个病人Notch1表达水平高于其配对的癌旁组织;免疫组化结果表明:17例OSCC切片中有11例病人癌组织的Notch1呈阳性,且其中部分病人癌组织分裂期细胞染色较深,显示强阳性结果;qRT-PCR及Western blot结果也显示3种OSCC细胞系中Notch1的表达均高于正常口腔上皮细胞NOK。3.MTT实验检测ACGs对OSCC细胞系SCC15和SCC25增殖的影响,结果表明:ACGs对SCC15和SCC25的增殖均有抑制作用,且随着ACGs剂量的升高,细胞凋亡数也增加,呈剂量依赖性。4.通过Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞技术发现ACGs诱导SCC15和SCC25细胞发生凋亡,特别是发现SCC15发生晚期凋亡。5.Western blot 结果表明:在 ACGs 作用下,SCC15 细胞中 Notch1、RBP-Jκ和Hes1的表达均随着剂量增加而减少,具有剂量依赖性。6.成功构建Notch1胞内段N1ICD真核表达质粒并在SCC15细胞中实现过表达。同未转染N1ICD的SCC15细胞相比,在ACGs作用下,过表达N1ICD的SCC15细胞的增殖明显;同未转染N1ICD的SCC15细胞相比,在ACGs和DAPT的共同作用下,过表达N1ICD的SCC15细胞的增殖能力被明显抑制。研究结论1.人Notch1基因在OSCC中是高频突变基因,其表达水平同OSCC的5年生存时间有关;进一步研究显示人Notch1基因在OSCC组织和细胞水平上有较高的表达,表明人Notch1基因可能与OSCC的发生和发展密切相关。2.ACGs对OSCC细胞生长增殖有抑制作用,能抑制OSCC细胞的增殖、诱导细胞凋亡和坏死,ACGs作用于OSCC细胞后,Notch1及RBP-Jκ和Hes1的表达下降。上调和抑制Notch1信号水平影响ACGs对OSCC增殖抑制。