本实验室前期利用Affymatrix基因芯片技术筛选出水培条件下受磷胁迫强烈诱导上调表达的基因Ta SPX3,该基因属于磷稳态调控密切相关的植物SPX家族,极有可能在小麦耐低磷机制中发挥重要作用。为进一步阐明该基因的作用机制,本研究从普通小麦品种郑麦9023中克隆了Ta SPX3基因全长c DNA序列,利用生物信息学手段对小麦SPX基因家族进行鉴定和进化分析,利用模式植物拟南芥作为载体构建过表达Ta SPX3植株进行功能分析。主要结果如下:1.小麦SPX基因家族的全基因组鉴定与进化分析本研究利用Ensemble数据库小麦基因组信息和拟南芥数据库以及Pfam数据库信息,使用Hmmer-3.1b2软件进行小麦全基因组SPX基因鉴定和分类,共得到了64个小麦SPX基因,可划分为3个亚家族,分别为SPX亚家族、SPX-EXS亚家族和SPX-MFS亚家族。利用Expasy分析SPX蛋白序列的一系列特征,小麦SPX基因的分子量范围是8281.72～97182.09 k Da;等电点介于5.19～10.17;蛋白质的总平均亲水性介于-0.967～0.201。利用Wolf Psort进行SPX蛋白亚细胞定位预测分析,结果表明12个小麦SPX基因定位在细胞核内,42个小麦SPX基因定位在质粒中,6个定位在细胞质中,仅有较少的定位在叶绿体中,还有2个细胞核与质粒中都存在。其中预测的Ta SPX3-6基因全长789 bp,编码262个氨基酸,等电点为8.91,蛋白分子量为29887.54,总平均亲水性为-0.309,定位在细胞质中,即为本研究目标基因-Ta SPX3基因。通过MEGA软件的Clusta W多序列比对和邻近法,选择相关物种的SPX基因进行进化分析,确认该基因与水稻Os SPX3具有最近的演化关系。这些生物信息学的预测分析可以为阐明Ta SPX3的功能提供理论基础。2.Ta SPX3拟南芥过表达株系的构建本研究克隆得到小麦Ta SPX3基因的全长c DNA序列,利用改造后的带GFP标签的p S1300载体,构建了Ta SPX3过表达重组载体,以农杆菌为媒介通过花絮侵染法转化拟南芥,利用潮霉素抗性筛选及表达检测获得阳性突变植株,经逐代的分子鉴定与自交纯合,得到T3代纯合的转基因植株。3.Ta SPX3过表达拟南芥株系的生理表型检测与基因表达分析野生型拟南芥和过表达拟南芥分别在幼苗期、成株期时进行磷胁迫处理即缺磷、低磷(5μM)、高磷(500μM)处理,观察测定生理指标发现:(1)过表达拟南芥与野生型拟南芥在幼苗期地上部的叶片颜色差别较明显,在拟南芥幼苗期的研究中,缺磷、低磷条件下转基因植株与野生型相比地上部呈现明显的绿色,而野生型则呈现墨绿色;同时转基因植株的侧根与野生型相比数量减少。这表明过表达Ta SPX3在苗期对拟南芥缺磷胁迫生理效应起到了缓解作用。(2)过表达拟南芥与野生型拟南芥在成株期生长过程中具有较大差异,在拟南芥成株期的研究中,低磷、高磷条件下转基因植株地上部几乎都抽穗、开花而野生型大部分没有。在缺磷条件下,转基因与野生型植株都抽穗,但是转基因植株的长势较野生型的好,这表明过表达Ta SPX3可以促进拟南芥在缺磷胁迫下的生长,而在低磷和高磷条件下促进生物量效应不明显,但均促使花期提前。q RT-PCR检测幼苗期、成株期在不同磷条件下Ta SPX3及拟南芥中几个磷调控相关基因(At RNS1、At IPS1、At SPX1、At PAP2、At PAP17和AT4)的表达量,过表达Ta SPX3,对拟南芥磷调控网络中的相关基因的表达存在一定的影响,这些拟南芥中磷胁迫响应基因表达量的改变会直接通过生理表型反应出来。4.过表达拟南芥中Ta SPX3基因的表达定位利用激光共聚焦显微镜观察在正常磷条件下培养7天的转基因植株,该转基因植株中携带Ta SPX3编码蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白,结果显示:Ta SPX3编码蛋白主要集中在根尖分生区的输导组织中,这一定位的具体作用机制尚有待进一步的研究。本实验通过生物信息对小麦Ta SPX家族的全基因组鉴定及蛋白性状预测,明确了Ta SPX3基因的分子特征,利用模式植物拟南芥过表达该基因研究了其生理功能、表达水平和组织定位。研究明确了Ta SPX3在植物减缓缺磷机制中的重要作用,为阐明Ta SPX3的生物学功能研究奠定基础。