第一部分埃克替尼联合培美曲塞对EGFR突变阳性肺腺癌移植瘤的疗效研究背景目前在世界范围内,肺癌的发病率和死亡率均位居所有恶性肿瘤的首位,其中非小细胞肺癌(NSCLC)占80%～85%,半数以上的NSCLC患者确诊时已属晚期阶段。肺腺癌是最常见的NSCLC组织亚型,占50%以上。以往含铂双药化疗是晚期NSCLC患者的主要治疗手段,然而其疗效已经达到了一个平台,中位生存时间徘徊在8～10个月。随着肿瘤分子生物学研究的不断进展,基于关键致癌性驱动基因研发的分子靶向药物相继问世,已经彻底改变了晚期NSCLC尤其肺腺癌的临床实践。表皮生长因子受体(EGFR)基因突变代表着最突出的NSCLC分子亚型,主要见于肺腺癌患者中,亦是预测治疗反应的重要生物标记物。数项大型临床研究证实,对于EGFR基因突变的晚期NSCLC患者,以EGFR为靶点的酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)一线治疗获得的总有效率和无进展生存期要明显优于化疗,故EGFR-TKIs已被广泛推荐为EGFR突变阳性患者的初始治疗。但是大多数此类患者不可避免地面临获得性耐药,如何使患者从EGFR-TKIs治疗中进一步获益并延缓耐药的发生已成为当前临床迫切需要解决的问题。另外由于恶性肿瘤存在异质性,单一的治疗手段存在局限性。因此,许多学者提出将EGFR-TKIs与化疗两种作用机制不同的药物联合应用可能会起到进一步提高疗效、延缓耐药的效果。然而,诸多研究所得出的结论并不一致,目前对这一策略是否真正给EGFR突变的NSCLC患者带来生存获益、EGFR-TKIs应与何种化疗药物联合以及采取何种联合方式尚存在争议。近年来,培美曲塞以其较好的抗肿瘤活性、较低的毒副作用与靶向药物联合治疗非鳞NSCLC成为研究的热点。已有多项体外实验和临床研究结果提示EGFR-TKIs与培美曲塞联合对EGFR突变的NSCLC有协同作用,但两类药物以哪种联合方式更佳、以及在体内的相互作用机制如何,仍需要进一步探讨。埃克替尼是第一代小分子EGFR-TKI,相对于吉非替尼或厄洛替尼半衰期较短,而且具有更好的脂溶性和安全性。目前尚无埃克替尼联合培美曲塞对EGFR突变阳性肺腺癌移植瘤模型抗肿瘤活性的研究报道。目的探讨埃克替尼与培美曲塞以不同的联合方式对EGFR突变阳性肺腺癌裸鼠移植瘤模型的抗肿瘤活性及潜在机制。方法1.移植瘤模型的建立:选取4-6周龄BALB/c-nu雌性裸鼠36只,饲养于SPF级环境中,将人EGFR突变阳性的肺腺癌HCC827细胞悬液接种于裸鼠右腋皮下,待肿瘤平均体积生长至150mm3,即造模成功。2.实验分组及给药方案将造模成功的裸鼠随机分为6组,每组6只,按照以下方案给药,均持续3周,所有联合组中的培美曲塞和埃克替尼剂量均按照各自单药组的剂量,每次给药前将埃克替尼溶于0.5%羧甲基纤维素钠,培美曲塞用生理盐水稀释。(1)空白对照(Control)组:予以每只0.5%竣甲基纤维素钠0.01ml/kg每天一次喂饲,每周5次。(2)埃克替尼(Ico)组:予以每只埃克替尼60mg/kg每天一次喂饲,每周5次;(3)培美曲塞(Pem)组:予以每只培美曲塞250mg/kg腹腔内注射,每周一次;(4)培美曲塞序贯埃克替尼(Pem-Ico)组:予以每只每周第1天腹腔内注射培美曲塞,第2-6天喂饲埃克替尼;(5)埃克替尼序贯培美曲塞(Ico-Pem)组:予以每只每周第1-5天喂饲埃克替尼,第6天腹腔内注射培美曲塞;(6)埃克替尼同步联合培美曲塞(Ico+Pem)组:予以每只每周第1-5天喂饲埃克替尼,每周第1天腹腔内注射培美曲塞;3.移植瘤生长曲线、抑瘤率和两药相互作用指数每3天测量一次裸鼠的体重、移植瘤体积,绘制各组移植瘤生长曲线。第21天实验结束后脱颈处死裸鼠,分离移植瘤并称量瘤重,一半肿瘤标本转移到-80℃冰箱冻存,另一半肿瘤标本石蜡包埋。按照公式“抑瘤率”(%)=[1-(给药组平均肿瘤重量/对照组平均肿瘤重量)]×100%计算各组抑瘤率。两药相互作用指数(coefficient of drug interaction,CDI)按公式CDI=AB/(A×B)评价,其中 AB为两药联合组与对照组的平均瘤重之比,A或B为各药物单药组与对照组平均瘤重的之比,当CDI<1时,表示两药联合有协同作用。4.HE染色观察每组移植瘤的组织学变化。5.免疫组化检测每组移植瘤组织CD34、PCNA、Ki-67和caspase-3蛋白的表达,以CD34阳性细胞计数评价移植瘤的微血管密度(MVD),以PCNA和Ki-67评分表示肿瘤细胞的增殖指数,以caspase-3评分表示肿瘤细胞的凋亡指数,评分方法设定为蛋白表达阳性细胞数占所有肿瘤细胞总数的百分比。6.蛋白质印迹法检测每组移植瘤组织中的胸苷酸合成酶(TS)、EGFR、phospho-EGFR,、AKT、phospho-AKT、MAPK、phospho-MAPK表达。7.通过监测各组裸鼠体重、行为变化评估药物治疗相关的不良反应。结果1.移植瘤生长、抑瘤率及两药相互作用指数情况随时间的延长,Control组移植瘤的体积逐渐增大,Pem组、Ico组与Ico-Pem组移植瘤生长减缓,而Pem-Ico组、Ico+Pem组移植瘤的体积逐渐减小。至21d时比较各组裸鼠移植瘤体积,Pem-Ico组、Ico+Pem组的移植瘤体积分别为(62.38±30.23)mm3 和(73.69±30.73)mm3,均明显小于 Control 组的(689.12±253.43)mm3、Pem组的(393.64±154.73)mm3、Ico组的(236.56±121.95)mm3及Ico-Pem组的(149.33±65.11)mm3(P<0.05),Ico组及Ico-Pem组的移植瘤体积明显小于Pem组(P<0.05),Pem组的移植瘤体积小于Control组(P<0.05)。而在Pem-Ico组与Ico+Pem组、Ico组与Ico-Pem组之间的移植瘤体积无显著差异(P>0.05)。抑瘤率从高到低依次为Pem-Ico组(87.8%)、Ico+Pem组(85.4%)、Ico-Pem组(73.2%)、Ico组(68.3%)、Pem组(41.5%)。。Pem-Ico组和Ico+Pem组的CDI分别为0.66、0.79。提示培美曲塞序贯埃克替尼、埃克替尼同步联合培美曲塞的方式均较埃克替尼、培美曲塞单药能明显抑制移植瘤的生长,可产生协同的抗肿瘤作用,而埃克替尼序贯培美曲塞的方式对抑制移植瘤的生长较埃克替尼单药无明显增效作用。2.移植瘤组织形态情况对照组肿瘤细胞增生明显且排列较紧密,核分裂象多见,肿瘤间质较少,经过药物治疗其它5组的移植瘤组织肿瘤细胞数目不同程度减少、纤维组织增多,以Pem-Ico组、Ico+Pem组最为明显。3.免疫组化检测移植瘤微血管密度结果各组之间MVD差异有统计学意义(F=86.49,P<0.05)。Ico组、Pem-Ico组、Ico+Pem 与 Ico-Pem 组的 MVD 分别为 25.62±2.35、18.02±2.94、19.93±2.14、26.72±2.32,均明显低于Control组的39.38±1.49和Pem组的36.85±2.29(P<0.01),Pem-Ico组、Ico+Pem组的MVD均明显低于Ico组、Ico-Pem(P<0.01),而Pem-Ico组与Ico+Pem组、Ico组与Ico-Pem组、Pem组与Control组之间的MVD差异无统计学意义(P>0.05)。表明培美曲塞序贯埃克替尼、埃克替尼同步联合培美曲塞的方式对减少移植瘤微血管密度有显著增强作用,而埃克替尼序贯培美曲塞的方式未显示有此作用。4.免疫组化检测移植瘤增殖与调亡指数结果与Control组比较,所有5个药物治疗组中由PCNA和Ki-67评分得出的增殖指数均有下降,而由caspase-3评分得出的凋亡指数增高(P<0.01);与Pem组比较,Ico组、Pem-Ico组、Ico-Pem与Ico+Pem组的增殖指数均明显下降,而凋亡指数均明显增高(P<0.01);与Ico组、Ico-Pem组比较,Pem-Ico组、Ico+Pem组的增殖指数显著降低,而凋亡指数显著增高(P<0.01);Pem-Ico组与Ico+Pem组、Ico组与Ico-Pem组之间的增殖指数和调亡指数差异无统计学意义(P>0.05)。提示培美曲塞序贯埃克替尼、埃克替尼同步联合培美曲塞的方式具有明显增强的抗肿瘤细胞增殖、促肿瘤细胞凋亡作用,而埃克替尼序贯培美曲塞的方式未显示有抑制肿瘤细胞增殖、促肿瘤细胞凋亡的增强作用。5.蛋白质印迹法检测结果Ico组、Pem组的TS表达水平均较Control组均有下降(P<0.05),而在Pem-Ico组、Ico+Pem组的TS表达水平较其它组下降更为显著(P<0.05)。phospho-EGFR、phospho-AKT和phospho-MAPK表达水平在所有包含埃克替尼的治疗组中有明显下降,而在Pem-Ico组、Ico+Pem组中下降更为明显(P<0.05)。另外,TS、phospho-EGFR、phospho-AKT和phospho-MAPK的表达水平在Ico组和Ico-Pem组、Pem-Ico组和Ico+Pem组之间并无显著差异(P>0.05)。与Control组相比,Pem组的phospho-EGFR水平轻度增高、phospho-AKT水平轻度下降,但差异无统计学意义(P>0.05),而phospho-MAPK水平差别不明显(P>0.05)。提示培美曲塞序贯埃克替尼、埃克替尼同步联合培美曲塞的方式均能显著增强抑制移植瘤组织中TS表达和EGFR信号通路磷酸化的作用。6.各组裸鼠的体重在治疗前后变化无统计学意义(P>0.05)。在实验期间各组裸鼠的活动、进食未受到明显影响。结论1.在EGFR突变阳性的肺腺癌(HCC827细胞系)裸鼠移植瘤模型中,培美曲塞序贯埃克替尼、埃克替尼同步联合培美曲塞的方式对抑制肿瘤生长均有协同作用,明显优于埃克替尼和培美曲塞单药,而埃克替尼序贯培美曲塞的方式对肿瘤生长的抑制较埃克替尼单药无明显优势。2.培美曲塞序贯埃克替尼、埃克替尼同步联合培美曲塞的方式明显增强了减少移植瘤微血管密度、抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用,因而产生了更好的抗肿瘤活性,而埃克替尼序贯培美曲塞的方式无以上增强作用。3.对移植瘤组织TS表达和EGFR信号通路活化抑制的增强作用,可在分子机制上解释培美曲塞序贯埃克替尼、埃克替尼同步联合培美曲塞所产生的协同抗肿瘤活性。第二部分埃克替尼联合化疗对EGFR突变阳性晚期肺腺癌初治患者的疗效研究背景非小细胞肺癌(NSCLC)是世界上死亡率最高的恶性肿瘤之一,其中组织亚型以肺腺癌为最常见。由于早期缺乏症状和有效的筛查,65%以上NSCLC患者明确诊断时已处于晚期阶段。以铂类为基础的双药化疗虽然能在一定程度上给晚期NSCLC患者带来生存获益,然而由于肿瘤细胞对化疗药物容易出现耐药,半数以上患者的生存期不超过1年。在过去的十年中,基于特定驱动基因突变的分子靶向治疗明显改观了 NSCLC尤其是肺腺癌的治疗状况,其中以EGFR基因突变的研究最为成熟、认知也最为广泛,针对EGFR突变的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)一线应用的疗效明显优于化疗,已推荐为EGFR敏感突变肺腺癌晚期患者的初始治疗选择,然而大多数患者接受第一代、第二代EGFR-TKIs治疗后通常在1 2月内出现获得性耐药,虽然已显示第三代EGFR-TKIs代表药物奥希替尼一线应用较前两代可使患者获得更长的无进展生存期(progression-free survival,PFS),但接受奥希替尼治疗的患者同样亦会不可避免发展成耐药,因此,应用EGFR-TKIs治疗EGFR突变肺腺癌的主要问题是如何延缓或预防TKIs耐药,以延长患者的PFS和总生存期(overall survival,OS)。已有研究探索EGFR-TKIs与化疗联合一线治疗能否改善EGFR突变阳性肺腺癌晚期患者的生存获益。虽然以往有研究提示吉非替尼或厄洛替尼与含铂化疗联合可延长此类患者的PFS、OS,然而由于研究方案不同,所得出的结果并不完全一致,联合治疗能否使EGFR-TKIs在一线治疗中的疗效得到提高,成为更佳的初始治疗策略,仍需要进一步探讨。埃克替尼为第一代EGFR-TKI,其疗效与吉非替尼相当,安全性相对更好,而铂类联合培美曲塞是晚期肺腺癌的一线标准化疗方案,目前尚无前瞻性、多中心、随机对照临床试验探索埃克替尼联合标准化疗一线应用是否亦能显著延长EGFR突变阳性晚期肺腺癌患者的PFS和OS。目的探讨埃克替尼联合化疗对比埃克替尼单药一线治疗EGFR突变阳性晚期肺腺癌患者的疗效差异与安全性。方法1.研究对象2014.01.16至2016.12.31期间经山东省10家三级综合医院收治的确诊为晚期肺腺癌且EGFR突变阳性的初治患者。2.研究方案(1)记录所有入组患者的基线资料,将纳入研究的患者随机分为2组:埃克替尼与标准化疗联合治疗组(简称联合组)及埃克替尼单药组(简称埃克替尼组)。联合组接受化疗序贯埃克替尼的嵌入式联合治疗,即在每个周期的第1天给予培美曲塞+卡铂,随后第2-19天口服埃克替尼直至下次化疗前两天,21天/周期,重复4-6个周期,之后没有疾病进展的患者口服埃克替尼维持治疗;埃克替尼组每天接受口服埃克替尼单药治疗。两组治疗均持续至出现疾病进展或不可耐受的毒副反应或死亡。(2)疾病进展后根据每位病人的实际病情由主治医师选择二线治疗方案:①进行外周血T790M突变检测,阳性者口服奥希替尼;②T790M突变阴性者可以选择全身化疗、放疗或射频消融、微波等局部治疗;③对于未行T790M突变检测的患者,缓慢或局部进展者继续应用埃克替尼或配合局部治疗,直至主治医师认为应停用埃克替尼,其它患者可选择接受全身化疗、放疗或局部治疗。3.观察指标(1)主要研究终点是PFS。(2)次要研究终点包括OS、客观缓解率(ORR)、疾病控制率(DCR)及不良反应发生率,并根据入组患者基线特征中的性别、年龄、吸烟状况、TNM分期、ECOG PS、EGFR突变类型及血清肺癌肿瘤标志物进行PFS的亚组分析。结果1.入组与随访情况共纳入EGFR突变阳性晚期肺腺癌患者179例,其中联合组90例,埃克替尼组89例。联合组中有6例患者出组,埃克替尼组中有8例患者出组,两组脱落率无统计学差异(6.7%vs.9.0%;χ2=0.335,P=0.563),最终对联合组的84例患者和埃克替尼组的81例患者进行疗效分析,对联合组的85例和埃克替尼组82例患者进行安全性分析。随访截止至2018年5月23日,最短随访时间为17个月,最长随访时间为53个月。联合组患者中64例(76.2%)进展,20例(23.8%)患者在随访时间截止时未进展;埃克替尼组有72例(88.9%)患者进展,9例(1 1.1%)患者在随访时间截止时未进展。两组患者疾病进展后二线治疗方案的差别均无统计学意义(均P>0.05)。2.生存分析(1)联合组患者的中位PFS显著长于埃克替尼组(16.0个月vs.10.0个月,HR=0.60,95%CI 0.42-0.85;χ2=8.037,P=0.005)。亚组分析显示联合组较埃克替尼组的PFS显著改善体现在:男性、年龄≥65岁、吸烟、分期为IV期、ECOG PS 1分、Exon-21突变、血清肺癌肿瘤标志物均正常、CEA正常或升高伴其它肿瘤标志物升高的患者,差异有统计学意义(均P<0.05)。(2)联合组41例(48.8%)患者疾病进展后死亡,43例(51.2%)患者在世;埃克替尼组52例(64.2%)患者疾病进展后死亡,29例(35.8%)患者在世;联合组的死亡率低于埃克替尼组(48.8%vs.64.2%,χ2=3.970,P=0.046)。但两组患者的中位OS差异无统计学意义(36.0个月vs.34.0个月,HR=0.77,95%CI 0.51-1.17;χ2=1.455,P=0.288)。3.缓解率联合组的ORR及DCR均高于埃克替尼组(83.3%vs.70.3%,χ2=3.909,P=0.048;96.4%vs.87.7%,χ2=4.374,P=0.036)。4.不良反应发生率联合组患者中白细胞减少总发生率显著高于埃克替尼组(40.0%vs.7.3%,χ2=24.475,P<0.001),且联合组中3-4级的发生率高于埃克替尼组(10.6%vs.0%,χ2=7.218,P=0.007);联合组患者中谷丙或谷草转氨酶升高发生率显著高于埃克替尼组(49.4%vs.20.7%,χ2=15.026,P<0.001),且3-4级的发生率高于埃克替尼组(11.8%vs.2.4%,χ2=5.442,P=0.02)。联合组患者中贫血、食欲减退、疲倦、恶心及脱发的总发生率均显著高于埃克替尼组(均P<0.01),但是两组3-4级的发生率差异无统计学意义(均P>0.05)。两组患者的血小板减少、总胆红素升高、呕吐、皮疹、腹泻及口腔黏膜炎的总发生率差异无统计学意义(均P>0.05)。联合组和埃克替尼组各有1例患者因全身皮疹3级停药退出研究,其余患者发生毒副反应时经及时对症处理和药物减量后均明显缓解,后续治疗未受影响。两组患者均无间质性肺炎及肾功能异常不良反应发生,均未发生药物相关死亡事件。结论1.对于EGFR突变阳性的晚期肺腺癌初治患者,埃克替尼与化疗嵌入式联合一线应用较埃克替尼单药治疗能明显延长PFS,提高ORR及DCR,而延长OS不明显。2.PFS的亚组分析提示男性、年龄≥65岁、吸烟、分期为IV期、ECOG PS 1分、Exon-21突变、血清肺癌肿瘤标志物均正常、CEA正常或升高伴其它肿瘤标志物升高的患者接受联合治疗可能更获益。3.在安全性方面,与埃克替尼单药相比,埃克替尼联合化疗3级及以上白细胞减少和肝功能损害的发生率增加,但经相应对症处理后患者均可耐受。