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从质体前体合成具有活性的叶绿体是植物生长过程中受到核基因和细胞质基因双重调控的代谢过程之一。但是,细胞质基因的调控能力是有限的,叶绿体的形成绝大部分受到核基因的调控,其中95％的蛋白质是核基因编码的。所以,在植物细胞叶绿体的生物合成过程中,通过细胞质基因和核基因精确的双重协调是必需的。叶色突变对研究叶绿素的合成和叶绿体的发育具有重要的利用价值。
本研究利用EMS处理粳稻品种日本晴(Nipponbare)的迟熟突变体10079,从后代中获得一个白化返绿突变体.gra75。对该突变体的形态特征、生理特性及主要农艺性状进行观察与分析,并应用.gra75/浙辐802 F2群体精细定位目标基因,遴选候选基因,主要结果如下:
1.gra75突变体的表型特征及主要农艺性状:在四川成都自然条件下。Gra乃突变体1～3叶呈绿色,与野生型亲本没有明显区别,但第4叶开始表现出白化,此后抽出的新叶直到第7片叶均为白化叶,第8叶开始转为正常绿色,原白化叶也会逐渐转为淡绿色。从孕穗期直到成熟期,gra75突变体在表型上与野生型没有明显的差异。成熟期调查株高、单株有效穗、穗长、每穗着粒数、结实率、千粒重等主要农艺性状,结果表明突变体与野生型亲本差异均不显著。
2.gra75突变体叶片的叶绿素及类胡萝卜素含量:.gra75突变体苗期白化叶片中的色素含量极显著低于野生型叶片中的色素含量,其中叶绿素α、叶绿素b和β-胡萝卜素的含量分别下降了88.3％、88.5％和79.3％,说明白化叶片的色素合成严重受阻。而gra75突变体返绿后,叶绿素和β-胡萝卜素的含量与野生型亲本差异均不显著,甚至略高于野生型,说明返绿叶片的色素合成也随之恢复J下常。
3.gra75突变体的叶肉细胞及叶绿体结构:gra75突变体白化叶片的叶肉细胞发育不完善,细胞器数目减少,叶绿体的形状不饱满且数目减少。野生型和突变型的叶绿体内部结构方面,二者的嗜锇粒数目没有明显的差异,且都均匀分布在叶绿体基质中,但gra75突变体叶绿体中类囊体片层、基粒和淀粉粒数目极显著减少,说明该突变体白化叶片的叶绿体发育受到严重抑制。
4.gra75突变性状的遗传分析:gra75突变体分别与正常绿色的粳稻品种日本晴及籼稻品种浙辐802和明恢63杂交F1代的植株均表现为正常绿色,F2代苗期可区分为差异明显的正常绿苗植株和白化突变植株2种类型,经卡方(X2)测验,这2种类型植株的分离比例均符合3:1,表明gra75的白化返绿突变性状由1对隐性核基因控制。
5.gra75突变基因的精细定位及候选基因分析:以gra75突变体与浙辐802杂交组合的F2作为定位群体,利用均匀分布于水稻12条染色体的308对SSR标记进行初步定位,并开发InDel标记加密定位区间,最终将该基因定位于第6染色体InDel标记HCl和HC2之间,遗传距离分别为0.06 cM和0.6cM,物理距离约为120kb的区域内。根据该定位区间内分子标记与目标基因的遗传交换率,对其中的预测基因进行分析和DNA测序,结果发现基因LOC Os06g-072lO(编码核糖核苷酸还原酶大亚基RNRLl)在编码区第716位碱基C突变成T,导致其编码蛋白第239位的丙氨酸(Ala)突变成缬氨酸(Val),因此,认为该基因是造成gra75白化叶突变的候选基因。该突变基因与已报道的水稻白条纹叶突变基因V3(Virescent3)为等位基因,但2个突变体的突变位点不同,表型也有较大差异。
6.gra75突变基因的潜在应用价值:gra75突变体苗期的白化返绿性状能稳定表达,且白化表型对后期的主要农艺性状影响不显著,故该突变基因作为叶色标记基因在水稻遗传育种中具有较大的应用价值。