论文部分内容阅读
目的：卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,由于缺乏早期诊断方法,术后易复发和化疗耐药的存在使其5年生存率一直徘徊在30%，严重威胁妇女健康。目前发现约90%的人类卵巢肿瘤起源于卵巢表面上皮(ovarian surface epithelium, OSE),其病因和发病机制迄今仍不清楚。因此,研究上皮性卵巢癌(ovarian epithelium cancer, OEC)的发病机制,对于防治卵巢癌具有重要意义。近年来的研究显示,卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)对上皮性卵巢癌的发生和发展具有重要作用。这种作用直接体现为FSH促进OSE细胞的恶性转化和FSH对上皮性卵巢癌细胞增殖的影响。但FSH对上皮性卵巢癌的作用机制,特别是对上皮性卵巢癌细胞增殖及凋亡影响的具体作用机理仍不清楚。虽然普遍认为FSH对细胞的作用是通过存在于细胞表面的FSH受体而实现的,但FSH与受体结合后的信号转导途径是如何作用的仍不明确,有待进一步研究。国内学者对此问题的研究多局限于组织水平,从分子水平研究上皮性卵巢癌发生过程中所涉及的信号转导途径等问题已成为目前国内外研究的热点。促进或阻断这些信号及其转导过程的关键环节将成为防治卵巢癌的重要策略。本研究通过体外培养上皮性卵巢癌细胞株,观察FSH对上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响,旨在探讨FSH在上皮性卵巢癌发生发展中的作用；同时通过研究PI3K/Akt(phosphoinositol-3-kinase/serine-threonine protein kinase B, PI3K/Akt)信号转导途径及其下游分子蛋白水平表达变化,旨在从分子水平探讨FSH调控上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的信号转导机制,为上皮性卵巢癌的治疗提供一种新的思路,并为其新的治疗策略提供实验依据。方法：将人卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV-3、人卵巢粘液性囊腺癌细胞株3AO置于37℃,饱和湿度5%CO2,含10%胎牛血清RPMI-1640培养基中常规培养,待细胞进入对数生长期后用于实验。1.光镜观察：将不同浓度的FSH及PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002作用于SKOV-3和3AO细胞株,在倒置相差显微镜下定时观察细胞的生长情况。2.MTT法：调整细胞浓度为1×105/ml,以每孔100ul培养于96孔培养板中,进入对数生长期后用不同浓度FSH(0、10、20、40、80、160mIU/mL)作用不同时间(0h、12h、24h、48h、72h),以FSH OmIU/mL为对照组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测药物对细胞的生长促进作用,筛选出药物作用的峰浓度及时间。3.流式细胞术：碘化丙啶(propidium iodide, PI)标记的流式细胞术检测各实验组SKOV-3和3AO细胞的细胞凋亡和细胞周期情况。实验分组如下：①Control组：仅以含10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养液培养细胞②LY294002组:10μmol/L LY294002作用于细胞③FSH组：40m IU/mL的FSH作用于细胞；④LY294002+FSH组：PI3K/Akt信号通路抑制剂]LY294002作用30min后加40m IU/mL FSH。4. Western blot检测以上各实验组SKOV-3和3AO细胞FSHR、Akt、p-Akt (Thr308)、突变型p53蛋白的表达情况。SKOV-3各实验组蛋白为药物作用48h后提取,3AO为24h后提取。5.应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。结果：1.倒置相差显微镜下观察可见,不同浓度FSH作用SKOV-3、3AO细胞后,随时间的延长,细胞的密集度明显增加,其增殖活性明显提高。PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002可明显抑制FSH对细胞增殖的刺激作用,促进细胞的凋亡。镜下可见,经PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002作用SKOV-3和3AO细胞后,部分细胞形状开始由梭形变为圆形,但细胞膜完整,然后细胞膜开始皱缩,圆形细胞逐渐增多。随后这些细胞体积普遍变小,形态不规则,胞质浓缩,胞膜不完整,贴壁能力减弱,最后漂浮。2.MTT结果显示,随着FSH浓度的增加,SKOV-3和3AO细胞的增殖活性较对照组有明显增强,差异均有统计学意义(均p＜0.05)。3.PI标记的流式细胞术检测细胞凋亡率显示：FSH可抑制SKOV-3和3AO细胞凋亡(1).FSH组SKOV-3细胞的凋亡率(0.26%±0.01%)低于Control组(0.33%±0.03%),(P＜0.05)；LY294002组SKOV-3细胞的凋亡率(1.43%±0.04%)和LY294002+FSH组凋亡率(1.41%±0.03%)均显著高于Control组和FSH组(均P＜0.05)；LY294002组与LY294002+FSH组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。(2).FSH组3A0细胞的凋亡率(0.29%±0.05%)低于Control组(0.39%±0.04%),(P＜0.05)；LY294002组3A0细胞的凋亡率(1.54%±0.03%)和LY294002+FSH组凋亡率(1.52%±0.07%)均显著高于Control组和FSH组,(均P＜0.05)；LY294002组与LY294002+FSH组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。4.PI标记的流式细胞仪检测细胞周期结果显示：FSH作用后,可促进SKOV-3和3AO细胞周期的改变(1).G0/G1期SKOV-3细胞数,FSH组(38.87%±0.76%)低于Control组(41.63%±0.41%) (P＜0.05); LY294002组(45.23%±0.40%)、LY294002+FSH组(46.70%±0.53%)明显高于FSH组(均P＜0.05)；LY294002组与LY294002+FSH组之间差异有统计学意义(P＜0.05)；S期SKOV-3细胞数FSH组(46.90%±0.36%)较Control组(43.53%±0.25%)明显增高(P＜0.05)；LY294002组(41.20%±1.34%)、LY294002+FSH组(40.57%±0.85%)均明显低于FSH组及Control组(P＜0.05)；LY294002组与LY294002+FSH组之间差异无统计学意义(P＞0.05)；G2/M期SKOV-3细胞数FSH组(11.57%±0.41%)、LY294002组(13.63%±0.15%)及LY294002+FSH组(12.87%±0.31%)均明显低于Control组(14.9%±0.10%)(均P＜0.05)；LY294002组、LY294002+FSH组也明显高于FSH组(P＜0.05)；LY294002组与LY294002+FSH组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。(2).G0/G1期3A0细胞数,FSH组(45.50%±1.25%)低于Control组(50.67%±0.71%)(P＜0.05)；LY294002组(53.83%±1.00%)、LY294002+FSH组(52.47%±0.38%)较FSH组明显增多(均P＜0.05)；LY294002组与LY294002+FSH组之间差异无统计学意义(P＞0.05)；S期3A0细胞数FSH组(26.13%±0.40%)较Control组(23.07%±0.45%)明显增高(P＜0.05)；LY294002组(17.40%±0.65%)、LY294002+FSH组(20.17%±0.25%)均低于FSH组及Control组(P＜0.05)；LY294002组与LY294002+FSH组之间差异有统计学意义(P＜0.05)；G2/M期3AO细胞数FSH组(28.43%±0.55%)明显高于Control组(26.30%±0.70%)(P<0.05)；LY294002组(28.87%±0.31%)及LY294002+FSH组(27.57%±0.37%)均明显高于FSH组(P<0.05)；LY294002组与LY294002+FSH组之间差异无统计学意义(P>0.05)。5.Western-bloting结果：(1). SKOV-3和3AO细胞均可检测到FSHR蛋白的表达,但SKOV-3细胞FSHR表达量较低,3AO细胞较高,两种细胞之间的差异有统计学意义(P<0.01)。进一步检测这两种细胞的各实验组之间FSHR蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。(2).FSH作用前后及应用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002后,Western blot分析各组Akt蛋白表达,结果显示两种细胞各实验组间Akt蛋白表达未见明显变化,差异无统计学意义(均P>0.05)。(3). SKOV-3和3AO细胞在基础状态下细胞内p-Akt(Thr308)水平较低,经FSH作用后其表达显著增多,经PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002干预后能明显降低两种细胞p-Akt表达水平。各组SKOV-3细胞p-Akt蛋白表达,FSH组(0.9433±0.002)高于Control组(0.8254±0.020)，(P<0.05),LY294002组(0.3664±0.008)及LY294002+FSH组(0.6498±0.022)低于FSH组,(P<0.05)。3AO细胞p-Akt蛋白的表达,FSH组(0.3488±0.006)高于Control组(0.2905±0.003) (P＜0.05), LY294002组(0.1931±0.006)及LY294002+FSH组(0.1669±0.007)表达低于FSH组,(P＜0.05)。(4).FSH处理过的SKOV-3和3AO细胞与对照组相比,突变型p53蛋白表达增加；抑制剂LY294002干预过的SKOV-3和3AO细胞突变型p53蛋白表达减少。SKOV-3细胞的突变型p53蛋白FSH组(1.3229±0.027)高于Control组(1.1798±0.039),而LY294002组(0.78316±0.024)和LY294002+FSH组(0.8437±0.068)突变型p53蛋白表达低于FSH组,(P<0.05)；3AO细胞突变型p53蛋白FSH组(1.0887±0.009)显著高于Control组(0.5540±0.034),而LY294002组(0.4887±0.008)和LY294002+FSH组(0.4205±0.008)突变型p53蛋白表达低于FSH组,(P＜0.05)。结论：1. SKOV-3和3AO细胞均表达FSHR蛋白,但SKOV-3细胞FSHR呈微量表达。2.FSH可促进体外SKOV-3和3AO细胞增殖,抑制其凋亡,PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002可抑制FSH引起的SKOV-3和3AO细胞增强的增殖能力,促进细胞凋亡。3.FSH可促进SKOV-3和3AO细胞周期的改变。FSH促进SKOV-3和3AO细胞周期向G1/S期转化,正性调控SKOV-3和3AO细胞周期进程,而PI3K/Akt通路阻断剂LY294002可阻滞SKOV-3和3AO细胞周期时相于G0/G1期,负性调控细胞周期进程。4.FSH在翻译水平可促进SKOV-3和3AO细胞p-Akt蛋白的表达,并引起突变型p53蛋白表达增加。PI3K/Akt通路阻断剂LY294002可抑制FSH引起的SKOV-3、3AO细胞中Akt磷酸化的上调,进而下调突变型p53蛋白的表达。5.FSH通过激活SKOV-3、3AO细胞中的PI3K对Akt的磷酸化,提高了PI3K/Akt信号通路的活性,进而导致突变型p53蛋白表达增加；这可能是其正性调控SKOV-3、3AO细胞周期、促进细胞增殖及抑制细胞凋亡的信号转导机制之一。6.体外实验提示FSH可能与卵巢癌的发生、发展有关。