DNA芯片作为一种高通量DNA分析检测手段,在基因表达、疾病诊断、药物筛选等领域具有广泛应用。目前,DNA芯片发展有两大趋势:其一是以Affymetrix公司为代表的向高密度基因芯片发展,争取把人类所有基因探针都固定在一块芯片上,其发展将对生物学的基础研究起到革命性的推动,并有可能在将来引发新的革命;另一种发展是以Nanogen公司为代表的过程集成化趋势,由于在实际临床诊断及军事、司法应用中,大多数情况下并不需要高密度的DNA芯片,而是要求便携式、灵活、速度快和成本低,因此,发展这种高集成、中低密度的DNA芯片可以在近几年进入市场并发挥社会效益。随着人类基因组计划的完成以及功能基因组研究的深入,要求对大量的基因信息进行高灵敏度、高特异性、定量化的检测。这对DNA芯片技术提出了挑战,同时也为DNA芯片技术的发展提供了机遇。然而,基因芯片的制备还存在着成本高、合成效率低等缺陷。例如,探针数量稍高传统的基因芯片价格在$150,000(US$1,220) to $350,000之间,价格十分昂贵;Affymetrix’s特有的光脱保护原位合成方法需要制作一系列特定的光掩模,成本高,不适合小批量需求,并且对不同的用户需求和不同的基因芯片必须重新设计光掩模。尚有待于完善,为此,我们提出了一种中、低密度DNA芯片原位合成方法—活版印刷法,它完全摒弃了原位合成中烦琐而昂贵的掩模制备过程及点样法中昂贵的探针修饰或标记,而是应用纳米微通道管状纤维载体材料按照预先设计的探针,排列组合成所需的一系列快速印刷母版,每一张母版对应于一种合成单体试剂。具有操作简单、成本低、单步合成产率高等优点。本论文的主要贡献如下:1.本文提出了一种适合于制备活版印刷法原位合成基因芯片的片基的方法——在0.01 mol/L NaOH/(H2O-CH3OH)的介质中水解微孔尼龙6膜,使其表面漏出活性氨基,然后直接用于DNA原位合成,可得到一种中、低密度原位合成基因芯片新片基。红外光谱和光电子能谱表征结果表明:在尼龙6膜表面形成了大量氨基;紫外光谱优化了水解条件:pH值为12、水解回流时间36小时、甲醇催化;该水解膜连接到391-DNA合成仪上,按照一定的程序合成5’-AAC CAC CAA ACA CAC-3’探针,收集每一步脱除的DMT溶液,测其紫外光谱,可计算其偶联效率大于98%。2.使用低温等离子体处理技术,制备了第二种适合于活版印刷法原位合成基因芯片的片基——以H2和N2混合气体等离子体处理了聚丙烯微孔膜,采用扫描电镜观察了处理前后膜的形貌变化;真空全反射红外光谱和X射线光电子能谱证实在其表面接枝了大量活性氨基;用紫外光谱定量计算得知,所接枝的氨基浓度大约为0.5μmol/cm2。该改性膜可直接用于DNA的原位合成,其合成的DNA探针密度远高于功能化玻璃片基的探针密度,并可得到98%以上的偶联效率。3.本论文分别采用氢气/氮气、氨气和氧气三种不同气氛的等离子体处理了聚丙烯片基,然后分别进行寡核苷酸原位合成。光电子能谱(XPS)证实了在其表面分别接枝了大量氨基和羟基。荧光扫描分析了在三种方法处理的聚丙烯片基上合成的寡核苷酸与靶序列杂交的荧光强度。结果表明:三种方法处理的聚丙烯片基都可用于DNA原位合成,但从处理工艺和荧光分析结果来看,均以氮气/氢气等离子体处理的聚丙烯片基最佳。4.本文将微流体装置连接到391 DNA合成仪上,在H2/N2等离子体处理的聚四氟乙烯表面直接原位合成了四条DNA探针,通过与荧光标记的靶序列杂交后,得到了一个32个点阵的寡核苷酸阵列。X射线光电子能谱证实了经等离子体处理的聚四氟乙烯表面接枝大量活性氨基;荧光扫描分析比较了在等离子处理的聚四氟乙烯片基上合成的四条寡核苷酸序列与靶序列杂交后的荧光强度,其互补序列(S1)、错配1、2和3个碱基的序列(S2 S3 S4)的荧光强度比值为117.8:78.4:13.89:7.97.结果表明:以H2和N2混合气体等离子体处理的聚四氟乙烯可以直接用于寡核苷酸原位合成,且具有很好的杂交特异性,有望成为一类高密度基因芯片新型片基。5.本文研究了活版印刷法DNA芯片制备原理与工艺流程:探讨了寡核苷酸的压印原理、固相合成方法以及手动活版印刷法DNA芯片制备设备,从反应池模具设计、纤维管的选择及合成工艺都做了详细描述。并对活版印刷法寡核苷酸原位合成条件进行了优化:对合成中各试剂的性质及其对偶联反应的影响;封闭试剂对寡核苷酸偶联效率的影响;四唑和核苷酸单体混合液的反应活性等因素进行了详细的探讨。通过上述工艺的研究,我们成功地应用活版印刷技术制备出了16个和160个位点的寡核酸阵列的芯片,各阵点上寡核苷酸的杂交荧光强度基本一致;通过与靶序列杂交,成功地获得了预想的结果,实现了单个碱基错配的检测。并将活版印刷法与点样法制备的160个位点的寡核酸阵列进行了比较。