【摘 要】
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真菌毒素是某些丝状真菌在食品、谷物原料及饲料等易染环境里生长时产生的次级代谢产物,监测谷物中毒素的污染水平是保障食品安全的重要前提。赭曲霉毒素A（ochratoxin A,OTA）是食品和农产品中主要的天然污染物之一,它的化学性质稳定,其极强的生物毒性会产生急性或慢性毒害作用,使人或动物的生命健康受到严重威胁。包括我国在内的多个国家和组织明确规定了谷物中OTA的限量标准,霉菌毒素污染已经成为影响谷
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真菌毒素是某些丝状真菌在食品、谷物原料及饲料等易染环境里生长时产生的次级代谢产物,监测谷物中毒素的污染水平是保障食品安全的重要前提。赭曲霉毒素A（ochratoxin A,OTA）是食品和农产品中主要的天然污染物之一,它的化学性质稳定,其极强的生物毒性会产生急性或慢性毒害作用,使人或动物的生命健康受到严重威胁。包括我国在内的多个国家和组织明确规定了谷物中OTA的限量标准,霉菌毒素污染已经成为影响谷物产品进入国际市场的主要原因。OTA的传统检测方法往往需要借助昂贵的设备和专业的人员进行,从而增加了食品安全控制的成本。为满足食品安全监测和快速检测的需求,构建用于OTA检测的简单、高效、灵敏的新型生物传感策略势在必行。本论文借助适配体识别结合磁分离技术,建立了两种检测OTA的荧光传感体系,旨在实现对谷物中OTA灵敏、可靠的检测。本文的主要研究内容如下:一、基于核酸外切酶Ⅲ辅助DNA循环信号放大方式检测谷物中赭曲霉毒素A本工作利用适配体识别结合核酸外切酶Ⅲ（exonuclease Ⅲ,Exo Ⅲ）辅助DNA循环扩增建立了一种灵敏检测谷物中OTA的荧光传感方法。功能化磁珠（magnetic beads,MBs）为信号探针（s DNA-FAM）的累积和分离提供了一种手段。OTA适配体（aptamer）与其部分互补的DNA（b DNA）杂交,OTA与aptamer特异性靶向识别后释放出b DNA,游离的b DNA捕获MBs上固定的s DNA-FAM信号探针,形成具有3′-平末端的酶切结构。Exo Ⅲ有效地水解其中的s DNA,释放出FAM荧光信号并诱导b DNA参与酶切循环反应,从而实现体系磁分离后溶液中FAM的累积和荧光信号的放大。验证了体系荧光信号与OTA的浓度在0.5 ng/m L～75 ng/m L范围内线性关系良好,计算得其检出限为0.28 ng/m L。此外,该方法应用于小麦和玉米样品中OTA检测也得到了令人满意的结果,回收率在97.7%～107.5%之间。该方法具有稳定性高、灵敏度高、实用性强等特点,在食品中毒素污染物监测领域展示出良好的应用前景。二、基于SYBR GreenⅠ探针的荧光适配体传感器检测谷物中赭曲霉毒素A本工作利用SYBR GreenⅠ（SGⅠ）探针结合磁分离技术设计了一种简单、灵敏检测谷物中OTA的荧光适配体传感方法。通过特异性生物素-链霉亲和素相互作用将aptamer固定在MBs表面以获得MBs-aptamer复合物,aptamer与DNA S1部分互补杂交,S1剩余部分进一步与DNA S2部分杂交,S2剩余部分与DNA S3部分杂交,以此类推,S2和S3杂交实现DNA线性扩增,获得具有多个S2/S3重复单元的MBs-aptamer/S1/S2/S3复合物。OTA与aptamer特异性靶向识别后,使aptamer/S1之间的杂交解体,有效地将S1/S2/S3这个较长的线性双链从MBs表面释放。游离在磁分离后溶液中的S1/S2/S3双链浓度与OTA浓度相关,S1/S2/S3对SGⅠ染料表现出荧光增强效应,其荧光强度与OTA从0.25 ng/m L到50 ng/m L范围线性相关,方法检出限为0.16 ng/m L。同时,该方法应用于小麦和玉米样品中OTA检测也获得了良好的检测结果,回收率在97.4%～108.2%之间。本方法设计简单、时间短、实用性强、成本低,为小分子靶标的定量分析提供了一个通用的适配体传感平台。
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