在我国的成人死亡原因分析中,脑卒中已悄然位居第一位,发病率逐年上升,并越来越趋向于年轻化。脑卒中的发病机制复杂,治疗手段有限。目前研究认为在急性期3-4.5小时内进行静脉溶栓是唯一有效而可行的治疗脑梗死的方法,但是由于急性期治疗时间窗比较严格以及可能发生颅内出血的风险,真正能接受此项治疗并从中获益的患者比较有限。大量动物实验证实,神经保护治疗措施具有可喜的治疗效果,但是,单纯的神经保护治疗在实际的临床治疗中效果欠佳。因此,为缺血性脑血管病寻找新的治疗靶点就显得格外重要。神经血管单元（neurovascular unit,NVU）主要包括脑微血管内皮细胞,胶质细胞,神经元及细胞间基质。这一新的概念的提出为治疗神经系统疾病提供了新的研究方向及治疗靶点。脑梗死发生后,也许我们只是防止神经元凋亡还不够,为了更好的恢复神经功能,我们必须尽力挽救神经血管单元的所有组分。血管新生,是指新生长的血管可以形成新的侧支循环,改善受损脑组织的血液供应,提供营养支持,不仅可以为这些可逆性损伤的神经元提供营养支持,而且可以为新生成的神经元创造良好的微环境,更有效的促进神经功能恢复,提高患者生活质量,改善患者预后。近年来,已经有临床研究证实,缺血半暗带区微血管密度与脑梗死患者的生存期呈正相关,微血管密度高的患者比密度低的患者生存期延长。因此,脑梗死后及时有效的促进新生血管形成,恢复缺血半暗带区的血液供应,从而为新生的神经元提供良好的营养支持,有效促进神经功能恢复。核转录因子Nrf2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2）,是一种小分子蛋白,由95-110个碱基组成,属于cap’n’collar（CNC）转录因子家族,其分子结构中有一个高度保守的碱基亮氨酸拉链（basic leucine zipper,bZIP）,在保护机体和抗氧化应激反应中发挥极其重要的作用。脑梗死后产生氧化应激,诱导产生过多的活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）,加重脑梗死后细胞损伤。同时ROS反应性激活Nrf2,转位进入细胞核,同时Nrf2激活其下游的一系列二相酶如:血红素氧化酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）、磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶-1（NADPH quinineoxidoreductase-1,NQO-1）和谷胱甘肽转移酶（glutathione S-thransferases,GST）等,在机体内提高抗氧化能力和解毒能力。Nrf2信号通路在脑梗死急性期发挥重要的抗氧化应激作用已经证实,但是Nrf2信号通路能否在脑梗死恢复期发挥神经保护作用尚无研究。Florczyk U等已经证明,Nrf2信号通路在体外实验具有促进血管内皮生成血管的作用,因此,我们推测Nrf2信号通路有可能在脑梗死恢复期血管再生过程中发挥重要作用,并猜想可能的作用机制进行研究。叔丁基对苯二酚（tert-butylhydroquinone,tBHQ）是Nrf2的诱导剂,促进Nrf2核转位及其下游的抗氧化酶的表达,具有强力抗氧化能力,从而发挥细胞保护的作用。已有研究证实,叔丁基对苯二酚对实验性小鼠脑梗死急性期具有保护作用,但目前尚无关于叔丁基对苯二酚对脑梗死后血管再生的影响及其作用机制的类似研究。本研究的研究对象为雄性CD-1小鼠和Nrf2基因小鼠,采用电凝法以制备小鼠局灶性脑梗死模型（dMCAO）,应用Nrf2诱导剂叔丁基对苯二酚进行干预,连续用药14天,通过对脑梗死体积和神经功能评分,观察叔丁基对苯二酚对脑梗死小鼠是否具有神经保护作用。通过免疫荧光方法观察各组小鼠的微血管密度、内皮细胞增殖,评估叔丁基对苯二酚是否具有促进实验性脑梗死小鼠血管再生的作用。通过观察应用叔丁基对苯二酚后,Nrf2/HO-1信号通路相关因子以及促血管生长因子表达的变化,探讨叔丁基对苯二酚促进脑梗死后血管再生的作用机制。本研究分为三部分,现将各部分内容概述如下。第一部分叔丁基对苯二酚对实验性脑梗死小鼠的神经保护作用目的:通过测定叔丁基对苯二酚治疗后实验性脑梗死小鼠的神经功能缺损评分和脑梗死体积的测定,观察叔丁基对苯二酚对实验性脑梗死小鼠的神经保护作用。方法:实验一选用成年雄性CD-1小鼠作为研究对象,采用电凝法制备小鼠局灶性脑梗死模型（dMCAO）。本部分实验将CD-1小鼠随机分为5组:假手术组（Sham组）:假手术后腹腔注射等量的3%无水乙醇,每日一次,连续注射14天;溶剂对照组（Vehicle组）:缺血后1天腹腔注射等量3%无水乙醇,每日一次,连续注射14天;小剂量用药组（L-tBHQ组）:缺血后1天腹腔注射叔丁基对苯二酚（t BHQ）20mg/kg,每日一次,连续注射14天。中剂量用药组（M-tBHQ组）:缺血后1天腹腔注射叔丁基对苯二酚（tBHQ）30mg/kg,每日一次,连续注射14天。大剂量用药组（H-tBHQ组）:缺血后1天腹腔注射叔丁基对苯二酚（tBHQ）40mg/kg,每日一次,连续注射14天。各组小鼠于造模成功后1天分别开始腹腔注射给药,并分别于术后1、7、14、28天进行行为学评分（rotarod试验）,每组10只。实验二根据行为学评分结果选取合适的叔丁基对苯二酚浓度,为进一步观察叔丁基对苯二酚能否通过Nrf2信号通路发挥作用。我们选用Nrf2基因小鼠作为研究对象,采用电凝法制备小鼠局灶性脑梗死模型（d MCAO）。实验二采用随机的方法,把Nrf2^+/+与Nrf2^-/-小鼠随机分为6组:将Nrf2^+/+小鼠分为三组:假手术组(Sham Nrf2^+/+组):假手术后腹腔注射等量的3%无水乙醇,每日一次,连续14天;溶剂对照组(Vehicle Nrf2^+/+组):缺血后1天腹腔注射等量3%无水乙醇,每日一次,连续注射14天;叔丁基对苯二酚用药组(tBHQ Nrf2^+/+组):缺血后1天腹腔注射叔丁基对苯二酚（tBHQ）（具体浓度依据行为学评分结果而定）,每日一次,连续注射14天。同时,将Nrf2^-/-小鼠分为三组:假手术组(Sham Nrf2^-/-组):假手术后腹腔注射等量的3%无水乙醇,每日一次,连续14天;溶剂对照组(Vehicle Nrf2^-/-组):缺血后1天腹腔注射等量3%无水乙醇,每日一次,连续注射14天;叔丁基对苯二酚用药组(tBHQ Nrf2^-/-组):缺血后1天腹腔注射叔丁基对苯二酚（t BHQ）（具体浓度依据行为学评分结果而定）,每日一次,连续注射14天。在造模成功后1天,各组小鼠分别开始腹腔给药。在术后第1、7、14、28天,各组小鼠分别采用rotarod试验进行行为学评分,每组10只。于术后7天,各组小鼠分别断头取脑,用TTC染色测定脑梗死体积（d7）,每组6只。结果:实验一叔丁基对苯二酚对CD-1小鼠神经功能缺损评分的影响分别对假手术组（Sham组）、溶剂对照组（Vehicle组）、小剂量用药组（L-tBHQ组）、中剂量用药组（M-tBHQ组）、大剂量用药组（H-tBHQ组）各组小鼠于术后1、7、14、28天通过rotarod试验进行神经功能缺损评分。Sham组小鼠无明显神经功能缺损表现。在脑梗死模型成功建立后1天,各组小鼠均有不同程度的神经功能缺损的表现,各组间无统计学差异（P>0.05）。与Vehicle组相比,L-tBHQ组和M-tBHQ组的神经功能缺损评分（rotarod试验）有所改善,但无统计学意义（P>0.05）。H-t BHQ组的神经功能缺损评分在7天明显改善,持续到梗死后第28天,且各个时间点的差异具有统计学意义（P<0.05）。实验二1.叔丁基对苯二酚对Nrf2基因小鼠神经功能缺损评分的影响分别对Sham Nrf2^+/+组、Vehicle Nrf2^+/+组、tBHQ Nrf2^+/+组、Sham Nrf2^-/-组、Vehicle Nrf2^-/-组、t BHQ Nrf2^-/-组小鼠于术后1、7、14、28天进行神经功能缺损评分。Sham Nrf2^+/+组和Sham Nrf2^-/-组无明显神经功能缺损表现。在脑梗死模型成功建立后1天,Vehicle Nrf2^+/+组、tBHQ Nrf2^+/+组、Vehicle Nrf2^-/-组、tBHQ Nrf2^-/-组小鼠均有不同程度的神经功能缺损的表现,各组间无统计学差异（P>0.05）。与Vehicle Nrf2^+/+组相比,在第7天,tBHQ Nrf2^+/+组神经功能缺损评分（rotarod试验）明显改善,一直持续到梗死后第28天,差异具有统计学意义（P<0.05）。在7天、14天、28天,与Vehicle Nrf2^+/+组相比,Vehicle Nrf2^-/-组小鼠的神经功能缺损评分（rotarod试验）均明显下降,且差异具有统计学意义（P<0.05）,但是叔丁基对苯二酚干预治疗后并没有明显改善（P>0.05）。2.叔丁基对苯二酚对脑梗死体积（d7）的影响Sham Nrf2^+/+组和Sham Nrf2^-/-组小鼠无梗死灶。在脑梗死模型成功建立后7天,Vehicle Nrf2^+/+组、tBHQ Nrf2^+/+组、Vehicle Nrf2^-/-组、tBHQ Nrf2^-/-组各组小鼠均有不同程度的梗死灶。梗死后7天,Vehicle Nrf2^+/+组皮层可见梗死灶,梗死体积为12.04%±0.78%,与Vehicle Nrf2^+/+组相比,叔丁基对苯二酚治疗后,梗死体积明显减小(7.90%±0.97%;Vehicle Nrf2^+/+vs.tBHQ Nrf2^+/+,P<0.05)。Vehicle Nrf2^-/-组梗死体积为15.24%±1.37%,叔丁基对苯二酚治疗后,梗死体积无明显变化,tBHQ Nrf2^-/-组梗死体积为14.61%±1.75%。小结:叔丁基对苯二酚能够改善脑梗死后神经功能缺损评分,减小梗死体积,在脑梗死恢复期发挥神经保护作用。第二部分叔丁基对苯二酚对实验性脑梗死小鼠血管再生的影响及其作用机制目的:本部分实验通过电凝法制备小鼠局灶性脑梗死模型,应用叔丁基对苯二酚（tBHQ）分别干预Nrf2^+/+小鼠和Nrf2^-/-小鼠,测定微血管密度和内皮细胞增殖,探讨叔丁基对苯二酚延迟性治疗能否促进脑梗死后血管再生及其分子机制。通过观察叔丁基对苯二酚对Nrf2信号通路的影响以及促血管生长因子的变化,进一步探讨叔丁基对苯二酚促进实验性脑梗死小鼠血管再生的可能机制,为叔丁基对苯二酚治疗脑梗死提供理论基础和实验依据。方法:本实验研究对象为Nrf2基因小鼠,采用电凝法制备小鼠局灶性脑梗死模型（dMCAO）。采用随机的方法,把Nrf2^+/+与Nrf2^-/-小鼠随机分为6组:将Nrf2^+/+小鼠分为三组:假手术组(Sham Nrf2^+/+组):假手术后腹腔注射等量的3%无水乙醇,每日一次,连续14天;溶剂对照组(Vehicle Nrf2^+/+组):缺血后1天腹腔注射等量3%无水乙醇,每日一次,连续注射14天;叔丁基对苯二酚用药组(tBHQ Nrf2^+/+组):缺血后1天内腹腔注射叔丁基对苯二酚（tBHQ）（40 mg/kg）,每日一次,连续注射14天。同时,将Nrf2^-/-小鼠分为三组:假手术组(Sham Nrf2^-/-组):假手术后腹腔注射等量的3%无水乙醇,每日一次,连续14天;溶剂对照组(Vehicle Nrf2^-/-组):缺血后1天腹腔注射等量3%无水乙醇,每日一次,连续注射14天;叔丁基对苯二酚用药组(tBHQ Nrf2^-/-组):缺血后1天腹腔注射叔丁基对苯二酚（tBHQ）（40 mg/kg）,每日一次,连续注射14天。在造模成功后1天,各组小鼠分别开始腹腔给药,并分别于术后7、14、28天进行免疫荧光化学染色,测定微血管密度及内皮细胞增殖,每组六只,讨论脑梗死后叔丁基对苯二酚延迟治疗能否促进血管再生。并分别于术后7、14天用Western Blot测定Nrf2、HO-1、VEGF的表达,每组六只,讨论脑梗死后叔丁基对苯二酚延迟治疗能否通过Nrf2/HO-1/VEGF通路促进血管再生。结果:1.叔丁基对苯二酚促进脑缺血后血管再生本实验主要采用免疫荧光方法检测微血管生成的情况。于缺血后7、14、28天断头取脑,进行免疫荧光染色,测定微血管密度。脑梗死7天后,在Nrf2^+/+小鼠,叔丁基对苯二酚治疗后,tBHQ Nrf2^+/+组小鼠的微血管密度较Vehicle Nrf2^+/+组明显增加（P<0.05）。而在Nrf2^-/-小鼠,应用叔丁基对苯二酚干预后,tBHQ Nrf2^-/-组小鼠的微血管密度与Vehicle Nrf2^-/-组相比,无统计学意义（P>0.05）。脑梗死后14天、28天微血管密度的变化与7天相一致。同微血管密度变化相一致,t BHQ Nrf2^+/+组BrdU/CD31阳性细胞数于缺血后14天较Vehicle Nrf2^+/+组显著增加（P<0.05）。2.叔丁基对苯二酚对Nrf2核转位的影响Western blot检测结果显示:梗死后7、14天,Vehicle Nrf2^+/+组小鼠梗死侧脑皮层的Nrf2的核蛋白表达上调,叔丁基对苯二酚药物干预后,tBHQ Nrf2^+/+组梗死侧皮层核蛋白较Vehicle Nrf2^+/+组相比上调,且差异具有统计学意义（P<0.05）。而在Nrf2^-/-小鼠,梗死后7、14天,Vehicle Nrf2^-/-组小鼠梗死侧脑皮层的Nrf2的核蛋白表达较Vehicle Nrf2^+/+组相比明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;应用叔丁基对苯二酚药物干预后,tBHQ Nrf2^-/-组梗死侧皮层核蛋白较Vehicle Nrf2^-/-组相比无统计学意义（P>0.05）。3.叔丁基对苯二酚升高HO-1、VEGF表达。Western-blot检测结果发现,与Vehicle Nrf2^+/+组相比,tBHQ Nrf2^+/+组HO-1、VEGF蛋白表达水平在7天、14天显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。然而在Nrf2^-/-组小鼠,Vehicle Nrf2^-/-组HO-1、VEGF蛋白表达水平明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。与Vehicle Nrf2^-/-组相比,应用叔丁基对苯二酚干预后,tBHQ Nrf2^-/-组HO-1、VEGF蛋白表达水平在7天、14天没有明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）。小结:1.叔丁基对苯二酚能够通过激活Nrf2信号通路增加脑梗死后微血管密度和内皮细胞增殖,促进脑梗死后血管再生。2.实验性脑梗死后,应用叔丁基对苯二酚干预,促进Nrf2核转位,激活Nrf2信号通路及其下游二相酶HO-1的表达,导致促血管生长因子VEGF表达增加。而在Nrf2基因敲除小鼠,叔丁基对苯二酚治疗后,HO-1及VEGF均无明显变化。这提示叔丁基对苯二酚有可能是通过激活Nrf2信号通路及其下游的HO-1,从而进一步增加VEGF的表达,从而实现促进脑梗死后血管再生作用。第三部分利拉鲁肽促进实验性脑梗死小鼠血管再生及其作用机制的研究目的:本部分实验通过观察利拉鲁肽对实验性脑梗死小鼠的神经功能缺损评分、脑梗死体积的测定,观察利拉鲁肽对实验性脑梗死小鼠的神经保护作用。通过对脑梗死后微血管密度和内皮细胞增殖及促血管生长因子VEGF的测定,探讨利拉鲁肽延迟性治疗能否促进脑梗死后血管再生及其作用机制。方法:实验一选用成年雄性CD-1小鼠作为研究对象,采用电凝法制备小鼠局灶性脑梗死模型（dMCAO）。随机将CD-1小鼠分为5组:假手术组（Sham组）:假手术后腹腔注射等量的生理盐水（normal saline,NS）,每日一次,连续注射14天;溶剂对照组（NS组）:脑缺血后1天腹腔注射等量NS,每日一次,连续注射14天;利拉鲁肽-小剂量组（L-Liraglutide组）:脑缺血后1天腹腔注射利拉鲁肽100μg/kg,每日一次,连续注射14天。利拉鲁肽-大剂量组（H-Liraglutide组）:脑缺血后1天腹腔注射利拉鲁肽200μg/kg,每日一次,连续注射14天。各组小鼠于造模成功后1天分别开始腹腔给药,连续用药14天,每日一次,并分别于术后1、7、14、28天采用rotarod试验方法进行行为学评分,每组10只。实验二根据行为学评分结果选取合适的利拉鲁肽剂量,进一步观察利拉鲁肽能否通过促进血管再生发挥神经保护作用。我们选用CD-1小鼠作为研究对象,采用电凝法制备小鼠局灶性脑梗死模型（dMCAO）。采用随机的方法,把CD-1小鼠随机分为3组:假手术组（Sham组）:假手术后腹腔注射等量的NS,每日一次,连续14天;溶剂对照组（NS组）:脑缺血后1天腹腔注射等量NS,每日一次,连续注射14天;利拉鲁肽组（Lirglutide组）:脑缺血后1天腹腔注射利拉鲁肽（具体浓度依据行为学评分结果而定）,每日一次,连续注射14天。在造模成功后1天,各组小鼠分别开始腹腔给药,连续用药14天,每日一次,并分别于术后1、7、14、28天进行行为学评分（rotarod试验）,每组10只。在术后第7天,各组小鼠分别断头取脑,采用TTC染色测定脑梗死体积（d7）,每组6只。并分别于术后14天、28天采用免疫荧光方法测定微血管密度及内皮细胞增殖,用Western Blot测定VEGF的表达,每组六只,讨论脑梗死后利拉鲁肽延迟治疗能否促进血管再生及其作用机制。结果:实验一利拉鲁肽对CD-1小鼠神经功能缺损评分的影响分别对假手术组（Sham组）、溶剂对照组（NS组）、利拉鲁肽-小剂量组（L-Liraglutide组）、利拉鲁肽-大剂量组（H-Liraglutide组）。在术后1、7、14、28天通过rotarod试验进行神经功能缺损评分。Sham组小鼠无明显神经功能缺损表现。在脑梗死模型成功建立后1天,各组小鼠均有不同程度的神经功能缺损的表现,各组间无统计学差异（P>0.05）。与NS组相比,L-Liraglutide组的神经功能缺损评分（rotarod试验）有所改善,但无统计学意义（P>0.05）。H-Liraglutide组的神经功能缺损评分在7天明显改善,持续到梗死后第28天,且各个时间点的差异具有统计学意义（P<0.05）。实验二1.利拉鲁肽对脑梗死体积（d7）的影响Sham组小鼠无梗死灶。在脑梗死模型成功建立后7天,NS组和Liraglutide组小鼠均有不同程度的梗死灶。应用利拉鲁肽治疗后,Liraglutide组小鼠梗死体积明显减小。2.利拉鲁肽促进脑梗死后血管再生本部分实验应用免疫荧光方法检测微血管生成情况。首先分别于缺血后14、28天取材进行免疫荧光染色,测定NS组和Liraglutide组小鼠微血管密度。脑梗死后14天,应用利拉鲁肽干预后,Liraglutide组小鼠的微血管密度较NS组明显增加（P<0.05）。脑梗死后28天微血管密度的变化与14天相一致。同微血管密度变化相一致,Liraglutide组BrdU/CD31阳性细胞数于缺血后14天较NS组显著增加（P<0.05）。3.利拉鲁肽升高VEGF表达。Western-blot检测结果发现,与NS组相比,在第7天、14天,Liraglutide组VEGF蛋白表达水平显著升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。小结:1.利拉鲁肽能够改善神经功能缺损评分,减小脑梗死体积,对实验性脑梗死小鼠恢复期发挥神经保护作用。2.实验性脑梗死后,利拉鲁肽可以增加脑梗死后微血管密度和内皮细胞增殖,通过增加促血管生长因子VEGF表达,促进脑梗死后血管再生,从而促进神经功能恢复。结论:1.叔丁基对苯二酚能够改善脑梗死后神经功能缺损评分,减小梗死体积,在脑梗死恢复期发挥神经保护作用。2.叔丁基对苯二酚能够通过激活Nrf2信号通路增加VEGF的表达,促进脑梗死后血管再生,促进脑梗死后神经功能恢复。3.利拉鲁肽能够改善神经功能缺损评分,减小脑梗死体积,可能通过增加VEGF的表达促进脑梗死后血管再生。