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研究背景叶黄素（lutein）是一种天然植物化学物,在结构上属于含氧类胡萝卜素。叶黄素具有多个共扼双键的特殊结构,使其具有抗氧化应激活性和多种生物学功能,包括抗炎症和抗肿瘤效应等。目前乳腺癌仍然是世界范围内的公共卫生困境,是严重威胁女性健康和生命的最常见的恶性肿瘤之一。在过去的二十年中,与乳腺癌相关的干预防治研究已经引导我们对乳腺癌发生发展及机制的理解取得了长足进展,从而进一步提高了治疗效果。活性氧关联许多肿瘤的发生发展,已经在多种肿瘤中检测到活性氧（Reactive Oxygen Species ROS）含量的增加。并且现已经显示出,活性氧作为信息分子,参与多种复杂信号转导通路及交叉对话（cross talk）,进而关联与肿瘤细胞的增值和凋亡等诸多生物学行为的变化。肿瘤细胞表达高水平的抗氧化防御蛋白,以衰减升高的ROS水平,建立氧化还原平衡。肿瘤细胞的氧化还原平衡与正常细胞的氧化还原平衡相比发生了显著改变,这表明干预细胞活性氧的状态可能是肿瘤干预防治的一个重要机制。核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythrocyte 2 related factor 2,Nrf2）作为重要的转录因子,已被证实是许多人类癌症中细胞抗氧化防御系统的主要因素。糖原合酶激酶3β（GSK-3β）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。GSK-3β通过与Nrf2的相互作用参与细胞氧化应激反应的调节,介导多种细胞生物学行为的变化。在ROS刺激的条件下,Nrf2介导一系列抗氧化防御蛋白及II型异源物代谢酶的产生。经典Keap-1依赖和非经典NF-κB和GSK-3β依赖性可以调节Nrf2介导的防御反应,调节Nrf2的表达和其下游防御蛋白如HO-1,NQO-1等的表达状态。研究目的本课题旨在探究叶黄素对人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖抑制效应。并基于活性氧（ROS）机制,揭示叶黄素通过NF-κB通路和GSK-3β/Fyn途径对细胞内最重要的抗氧化防御转录因子Nrf2表达状态和活性的影响,以及Nrf2下游信号抗氧化酶或蛋白的表达水平的变化等分子机制,为叶黄素用于乳腺癌的化学干预提供理论依据。方法1.用浓度5,10,20,40,80μM的叶黄素干预处理人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞株,分别处理12,24,48小时。0μM组作为空白对照组。MTT比色法评估叶黄素对对细胞增殖抑制的影响。通过每种浓度的细胞存活率百分比计算IC50。2.使用流式细胞术观察叶黄素（10,20,40μM）干预处理的MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞的凋亡率;用Western blot分析叶黄素处理细胞中凋亡相关蛋白caspase-3的表达量的变化。3.用不同浓度叶黄素（10,20,40μM）和过氧化氢（阳性对照）分别处理MDA-MB-231和MCF-7细胞后,使用流式细胞术DCFH-DA检测细胞内的活性氧（ROS）水平。4.MDA-MB-231和MCF-7暴露于不同剂量的叶黄素（10,20,40μM）和H2O2,然后进行核质分离实验收集蛋白。5.叶黄素处理后,用Western blot检测MDA-MB-231和MCF-7细胞中Keap-1的蛋白质水平,以及分别检测胞质和胞核中Nrf2蛋白水平。6.叶黄素处理后,分别用Western blot和RT-qPCR检测MDA-MB-231和MCF-7细胞中HO-1,NQO-1的mRNA和蛋白表达水平。7.Western blot分析叶黄素干预处理的MDA-MB-231和MCF-7细胞中,NF-κB,GSK-3β/Fyn通路相关蛋白的表达量;用RT-qPCR在mRNA水平检测Nrf2变化情况。结果1.MTT检测显示,叶黄素处理人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞,具有显著增殖抑制作用,并且呈现剂量依赖关系。2.流式细胞术结果显示,与未处理组相比,叶黄素干预处理的人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞的凋亡率随浓度增加而增加,Western blot结果亦显示caspase-3的表达水平随叶黄素的增加而升高。3.叶黄素干预处理的人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞,其ROS水平显著降低,而过氧化氢干预处理的细胞ROS水平则显著升高。4.叶黄素显著下调MDA-MB-231和MCF-7细胞胞质和细胞核中Nrf2的表达水平,增加Keap-1的表达水平,并且下调Nrf2下游靶蛋白HO-1和NQO-1的mRNA和蛋白表达水平。采用过氧化氢干预处理处理,可逆转该表达状态。5.Western blot结果表明:叶黄素干预处理在NF-κB通路中可抑制Ikkα,IKBα的磷酸化,进而抑制P65的核转位,在mRNA水平降低Nrf2的表达,但可被过氧化氢逆转。在GSK-3β通路中,叶黄素抑制了Gsk-3B的磷酸化,增加Fyn核易位,但过氧化氢则增强Gsk-3β的磷酸化,抑制Fyn的核易位。结论1.叶黄素可显著抑制人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞的增殖。2.叶黄素抑制人乳腺癌细胞的增殖的机制,可能是通过降低乳腺癌细胞ROS水平,并基此下调NF-κB信号通路介导抑制Nrf2的表达,并通过GSK-3β/Fyn途径导致Nrf2核定位减少,进一步降低抗氧化防御基因HO-1和NQO-1的mRNA和蛋白表达水平来实现的。