灭活草分支杆菌雾化吸入对支气管哮喘气道炎症和Vγ1+、Vγ4+γδT细胞亚群的影响

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第一部分雾化吸入灭活草分支杆菌减轻哮喘小鼠气道炎症及对细胞因子IL-4、IL-10、IFN-y的影响目的:探讨雾化吸入灭活草分支杆菌对支气管哮喘小鼠气道炎症及肺组织细胞因子分泌的影响。方法:将50只雄性Balb/c小鼠按随机数字表法分为4组:正常对照组(A)、哮喘模型组(B0、B3、B4、B5)、治疗组(C0、C3、C4、C5)、预防组(D)。用卵清蛋白(OVA)致敏和激发制成小鼠支气管哮喘模型。C组在卵蛋白激发后给予雾化吸入草分枝杆菌治疗,一天一次,C3、C4、C5分别治疗3天、4天、5天,D组在每次OVA激发前给予草分枝杆菌雾化吸入,一天一次。各组动物处死后提取肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)。肺组织进行病理HE染色、AB-PAS染色观察支气管肺炎症和气道粘液分泌情况,并行病理半定量分析。BALF离心后行炎症细胞计数,计算细胞总数及分类计数;酶联免疫吸附法检测BALF上清液中IL-4、IL-10、IFN-y水平。采用SPSS17.0软件统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,组内两两比较采用LSD法,病理半定量结果采用非参数秩和检验。结果:BALF中IL-4值治疗4天组(15.35±3.53)、5天组(14.48±4.21)、预防组(14.60±2.89),分别较同期模型组(分别是28.41±4.45,30.524±3.57,26.81±3.59)减少(P<0.01),IL-10值治疗4天组(70.00±6.28)、5天组(70.72±5.40)、预防组(71.36±6.46)较同期模型组(分别是46.53+4.41,45.47±4.14,47.68-4.47)增加(P<0.01), IFN-γ值治疗4天组(243.80-58.78)、5天组(248.40-62.53)、预防组(259.00±43.29)较同期模型组(分别是166.20-54.25,157.20-51.74,175.20±55.35)增加(P<0.05),BALF中嗜酸性粒细胞比例低于模型组,治疗5天组、预防组气道炎症病变均较模型组减轻,病理半定量结果差异有显著性(P<0.05)。结论:雾化吸入草分枝杆菌能减轻支气管哮喘小鼠气道炎症,其效应与调节细胞因子分泌有关。第二部分灭活草分支杆菌雾化吸入对支气管哮喘小鼠γδT细胞功能和Vy4+γδT细胞亚群的影响目的:观察雾化吸入灭活草分枝杆菌对哮喘小鼠气道炎症和γδT细胞功能的影响,探讨草分枝杆菌治疗哮喘与γδT细胞分泌细胞因子和Vγ1+、Vy4+γδT细胞亚群的关系方法:雄性Balb/c小鼠随机分为3组,每组6只,分别为:空白对照组(A),哮喘模型组(B),治疗组(C)。 OVA致敏激发制备支气管哮喘模型,C组予以草分枝杆菌雾化吸入治疗5天。治疗结束24小时内处死小鼠,收集肺组织标本。病理HE染色观察肺部及气道炎症状况。免疫组化染色检测肺内γδTCR表达以了解肺内γδT细胞分布。流式细胞学检γδT细胞胞内细胞因子IL-10和IFN-y。荧光定量PCR检测肺内Vγ1mRNA、Vy4mRNA表达量。结果:治疗组小鼠气道炎症较模型组明显减轻;IL-10+γδT细胞,IFN-γ+γδT细胞比模型组增加,有统计学差异(P<0.05);治疗组小鼠肺组织Vy4mRNA表达量较模型组增加,Vγ1mRNA表达量较模型组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:雾化吸入灭活草分枝杆菌能调节γδT细胞功能和Vγ1+、Vy4+γδT细胞亚群数量,其减轻哮喘气道炎症的作用可能与调节γδT细胞功能和亚群比例有关。第三部分雾化吸入灭活草分支杆菌减轻哮喘小鼠气道炎症及对TOLL样受体2表达的影响目的:研究雾化吸入灭活草分支杆菌对支气管哮喘小鼠气道炎症及肺组织细胞因子分泌的影响,探讨TOLL样受体2(TLR2)表达在雾化吸入灭活草分支杆菌防治支气管哮喘中的作用。方法:将24只雄性Balb/c小鼠按随机数字表法分为3组,每组8只:正常对照组(A)、哮喘模型组(B)、干预组(C)。卵清蛋白(OVA)致敏制成小鼠支气管哮喘模型。C组在每次卵蛋白激发前给予雾化吸入草分枝杆菌治疗,一天一次。各组动物处死后提取肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)。进行病理HE染色、AB-PAS染色观察支气管肺炎症和气道粘液分泌情况,并行半定量分析。BALF中炎症细胞计数,检测BALF中IL-4、IL-10、IFN-y水平。实时定量PCR检测肺组织TLR2mRNA表达水平。结果:干预组BALF中IL-4分泌减少,IL-10、IFN-y增加(P<0.05),BALF中嗜酸性粒细胞比例低于模型组,气道炎症病变较模型组减轻,肺组织TLR2mRNA表达水平较模型组显著升高(P<0.05)。结论:雾化吸入草分枝杆菌能减轻支气管哮喘小鼠气道炎症,其效应与调节肺内细胞因子分泌有关。草分枝杆菌可能通过上调TLR2基因的表达调节支气管哮喘的免疫失衡。第四部分雾化吸入草分枝杆菌对中度持续哮喘患者的治疗作用观察目的观察雾化吸入灭活草分枝杆菌治疗中度持续支气管哮喘的临床效果方法收集2010年6月至2011年3月广西医科大学第一附属医院门诊确诊为支气管哮喘患者,满足纳入标准:1)年龄大于18岁;2)支气管舒张实验阳性或支气管激发实验阳性;3)根据中华医学会《支气管哮喘防治指南》符合慢性持续性中度标准(即:每日均有症状;发作影响活动和睡眠;夜间哮喘症状≥每周一次;FEV1为69%-79%预计值或PEF为69%-79%个人最佳值);4)无明显呼吸道感染5)从未接受糖皮质激素或如何抗炎治疗。中度持续性哮喘患者28名,随机分为两组:治疗组(A组)和对照组(B组),每组14名患者。两组患者性别组成、年龄构成比无差异。A组患者给予雾化吸入灭活草分枝杆菌溶液治疗,一天一次,连续5天,且在一月后重复一次疗程。B组患者沙美特罗氟替卡松粉吸入剂,每天2次,持续应用。在第1天,第6天,第31天和第91天行肺功能检测和支气管激发试验,收集FVC, FEV1, PEF,记录乙酰甲胆碱累积量FEV1-PD20。治疗前、治疗后1月、3月末行ACT评分。结果:A组患者治疗后,FEV1和治疗前相比有上升趋势,但无统计学意义。B组患者第91天FEV1较治疗前明显升高(P<0.05),两组PEF值在治疗后第6天,第31天和第91天均有升高(P<0.05),A、B两组之间无明显差异。B组FEV1占预计值比值(FEV1%)第31天、第91天高于A组(P<0.05)。A、B两组FEV1-PD20值治疗后第6天,第31天和第91天均较治疗前增加(P<0.05),两组之间无明显差异。两组患者治疗后激发试验转阴率,经卡方检验两组间相比差异无统计学意义(P>0.05)。两组ACT评分第31天、第91天较治疗前明显升高,有统计学意义(P<0.01)。结论:雾化吸入灭活草分枝杆菌一定程度上改善哮喘症状,减少急性发作和需要使用缓解药的次数。和沙美特罗氟替卡松吸入在减轻哮喘气道高反应性方面具有相同效果。雾化吸入草分枝杆菌可能作为一种更安全方便和依从性更好的哮喘替代治疗方法。
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