先天性心脏病(Congenital heart disease,CHD)是全球范围内最常见的先天性出生缺陷,约占所有主要出生缺陷的28%。其临床表型多样,包括室间隔缺损(Ventricular septal defects,VSDs),房间隔缺损(Atrial septal defects,ASDs),动脉导管未闭(Patent ductus arteriosus,PDA),肺动脉狭窄(Pulmonary stenosis,PS),法洛四联症(Tetralogy of Fallot,TOF)等。在亚洲,先天性心脏病的出生患病率约为0.93%,显著高于其他五大洲。而在我国,据卫生部2012年出生缺陷防治报告统计,自2005年起,先天性心脏病已成为我国围产儿第一高发出生缺陷,其中2011年出生的CHD患儿约24万,占所有监测出生缺陷的26.7%。法洛四联症是最常见的青紫型心脏病,是由于胚胎时期圆锥动脉干发育异常所致,主要包括(1)室间隔缺损;(2)主动脉骑跨;(3)肺动脉狭窄;(4)右心室肥厚等4种表型,其出生患病率约为1/3000,占全部先天性心脏病的5%。与其他亚型先天性心脏病相比,法洛四联症患儿常出现严重缺氧、顽固性充血性心力衰竭等严重表型,自然预后不佳,目前手术矫正治疗虽能避免患儿早期死亡,但部分患儿仍存在术后残余问题和并发症,或终生伴随心律失常、心室功能障碍等后遗症,给患儿家庭和社会带来沉重的经济和精神负担。先天性心脏病的致病因素通常分为遗传因素和环境因素,环境因素主要包括母体疾病,病毒感染和致畸物暴露等。另一方面,随着基因组学方法的发展,越来越多的遗传学因素逐渐被发现。染色体数目异常作为第一个被发现的先天性心脏病遗传学致病因素,至今为止仍然是其主要致病原因。而拷贝数变异(Copy number variations,CNVs)作为染色体结构变异的一种,通常改变一系列基因的剂量,与多个亚型的先天性心脏病发生有关。以往基于家系的连锁分析和候选基因序列分析发现了一些先天性心脏病的致病突变,但是局限于少数已知的心脏发育相关重要基因的编码区突变。目前,通过新一代的测序技术,直接对整个外显子组或者基因组进行测序,越来越多的先心相关基因被发现,如心脏发育相关转录因子基因(NKX2-5,GATA4,TBX1,IRX4等),发育相关信号通路基因(ZIC3,DDAL,LEFTY2等)以及心脏结构蛋白相关基因(MYH6,MYH7 等)。法洛四联症作为青紫型先天性心脏病中最常见的亚型,是一种存在复杂表型和形态学的心脏畸形。以往家系研究和流行病学研究发现了一些遗传致病因素,例如1q21.1区域的拷贝数变异,或转录因子基因上的显性突变等。最近有研究表明,已知或新发的先天性心脏病突变均存在一定程度的不完全显性,其中染色体22q11.2区域(TBX1)拷贝数缺失被认为是法洛四联症的致病因素之一,但其在正常人群中频率约为1/4000,家系样本中的无症状成员也会携带该拷贝数变异。但是大部分的法洛四联症患者的遗传病因并不明确,随着ENCODE(Encyclopedia of DNA Elements)等大型非编码区研究项目的开展,非编码区域突变受到越来越多的关注。为了深入研究单纯法洛四联症的遗传学病因,本研究采用高通量全基因组测序(Whole-genome sequencing,WGS),荧光定量 PCR(Polymerase chain reaction),AccuCopy拷贝数变异分析以及TaqMan基因分型等技术,通过大样本、多阶段、多中心设计,并结合CRISPR/Cas9基因编辑技术,荧光素酶报告基因实验,荧光定量PCR检测心脏组织基因表达等体内外实验验证人群遗传学发现。本研究主要包括以下几个部分:初筛阶段:共纳入来自江苏的5个直系亲属无先天性心脏病的单纯TOF核心家系(患者和健康父母),20例单纯TOF病例以及50例正常对照(全基因组测序样本),所有这些样本均进行全基因组测序以及单核苷酸多态性芯片分析。测序结果表明,这些样本在编码区并不存在与单纯TOF相关的重复突变,但存在3例重复出现的TBX1杂合缺失TOF病例,并且发现其中一位病例(Trios 001)的无症状母亲同样携带该缺失。随后,在来自江苏的另外277例单纯TOF病例和2105例进行CNV扩大样本验证。结果表明,在所有302例单纯TOF病例中共发现20例TBX1杂合缺失,发生频率显著高于正常对照(6.62%0.09%,OR=76.35,P=3.68e-32)。鉴于TBX1杂合缺失在正常人群中约0.09%的携带率以及其中一例病例的TBX1杂合缺失遗传自其健康母亲,并且,全基因组测序并未在编码区发现单纯TOF相关的重复突变,因此,本研究根据“增强子-启动子交互作用对”TBX1基因非编码功能区进行注释和突变筛选,共发现两个潜在增强子区域(Region 1:chr22:19737401-19739401,Region 2:chr22:19748804-19750763)。在 25 例全基因组测序的单纯TOF病例中,共发现了 8个突变,其中Mut3(g.19738665G>C)重复出现,并且Trios 001样本同时携带TBX1杂合缺失和潜在非编码区突变Mut3,分别遗传自其健康父母。此外,Mut 1(g.19737694C>T)和 Mut4(g.19749542G>A)也分别与TBX1杂合缺失同时存在于同一个病例。随后,本研究对277例单纯TOF病例的两个潜在增强子区域进行测序,在这302例单纯TOF病例中,发现4 个潜在增强子区域的 recurrent 突变(Mut1:g.19737694C>T,Mut2:g.19737957A>C,Mut3:g.19738665G>C,and Mut4:g.19749542G>A)。随后,通过TaqMan分型检测了这4个突变在2105例正常对照中的频率。测序和分型结果表明,Mut1和Mut2仅存在于单纯TOF病例中,Mut4显著增加单纯TOF的发病风险(OR=9.05,P=2.68e-05),而Mut3在病例与对照之间并无显著差异。突变合并分析结果显示,Mut1,Mut2和Mut4这3个recurrent突变的携带者,单纯TOF的发病风险升高了 16.52倍(2.98%vs.0.19%,P=5.12e-10)。此外,1642例ASD和VSD样本中TBX1杂合缺失以及这3个recurrent突变频率检测结果显示,这些变异均特异性与法洛四联症发病相关。外部验证阶段:该阶段纳入了来自西安,济南等多中心的516例单纯TOF病例和2276例正常对照。拷贝数变异验证结果显示,病例中TBX1杂合缺失频率(34/516,6.59%)显著高于对照(2/2276,0.09%)(OR=80.20,P=4.55e-53)。而3个潜在增强子突变验证结果提示,Mut2(0.19%vs.0.02%,OR=4.42,P=2.22e-2)和 Mut4(0.39%vs.0.07%,OR=2.95,P=3.18e-2)同样显著升高单纯TOF发病风险,Mut1未能在验证样本中发现。合并初筛与外部验证两部分结果显示,TBX1杂合缺失携带者单纯TOF的发生风险升高78.23倍(6.60%vs.0.09%,P=2.45e-81)。而携带任意潜在增强子突变,将导致单纯TOF发病风险升高超过6倍(1.47%vs.0.18%,OR=6.14,P=2.21e-04)。而当携带TBX1杂合缺失或任意潜在增强子突变,其单纯TOF发病风险将增高 28.10 倍(7.09%vs.0.27%,P=2.21e-61)。功能验证阶段:为了进一步验证和阐明与单纯TOF发生相关的TBX1潜在增强子区域以及区域内相应突变的功能,本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,荧光素酶报告基因和心脏组织表达等体内外检测方法,验证了这两个非编码区域以及其中突变的功能。基因编辑实验结果表明,在这两个非编码区域杂合敲除和纯合敲除的HEK293T细胞克隆中(Region+/-,Region-/-),TBX1基因的表达显著低于野生型克隆(Region+/+),并且纯合敲除克隆相对更低,提示这两个区域存在增强子功能,而且存在一定的剂量-反应模式。荧光素酶报告基因检测结果显示4个重复出现的突变破坏了增强子的功能,报告基因表达显著降低。最后,患者心脏组织TBX1基因表达检测结果显示,携带突变的心脏组织的TBX1基因表达显著降低(P=0.03,t-test),并且同时携带TBX1拷贝数缺失和TBX1基因增强子区域突变组织的TBX1基因表达最低(P=2.9e-3,t-test)——表达量只有对照组织的十分之一左右。为了验证潜在增强子对TBX1表达以及TBX1表达对心脏前体细胞增殖和分化的影响,本研究通过采用敲除潜在增强子区域的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)诱导心肌细胞分化实验。在心脏前体细胞阶段,敲除增强子区域的干细胞克隆(Region 1+/-)和Region 2-/-)与未敲除的细胞克隆(Region+/+)相比,TBX1基因的表达显著降低,心脏前体细胞标志基因(NKX2-5,ISL1,GATA4)表达提前(Day 4-8 vs.Day 6-8),提示TBX1基因表达降低可能导致心脏前体细胞分化提前。并且细胞周期实验提示在该阶段敲除增强子区域的心脏前体细胞(Region 1+/-和Region 2-/-)的增殖活性低于野生型克隆(Region+/+)。综上所述,首先本研究通过大样本、两阶段、多中心的病例对照研究,确定了单纯法洛四联症中TBX1拷贝数缺失的发生率约为6.60%,随后通过对非编码区注释以及人群验证,发现TBX1增强子区域的3个recurrent突变与单纯TOF发病显著相关。并且通过体内外功能实验证实了这些区域缺失与相应突变导致TBX1基因表达降低。最后通过对比其他亚型的先天性心脏病,如ASD和VSD,发现TBX1拷贝数缺失和增强子区域的突变特异性地与单纯法洛四联症的发生相关。上述研究结果为法洛四联症高危人群的遗传咨询,为产前筛查或者胚胎植入前诊断提供了重要的临床评价工具,为实现我国优生优育的国策进一步提供科学理论依据。