基质金属蛋白酶（MMP）是可以降解细胞外基质的水解酶，参与到许多生理过程，包括组织重塑和修复。它们在脊椎动物中被作为特殊的研究对象，在人类中已经发现了25种家族成员。大多数MMPs结构上是由前肽、催化结构域和血红素样结构域组成，分别发挥不同作用。前肽，使MMPs保持无活性酶原形式，去除后被激活；催化结构域具有水解酶活性；血红素样结构域具有识别底物的功能。在许多病理情况下，会过量表达MMPs，或是它们的活性调控失去平衡，伴随疾病发展恶化，如关节炎、心血管疾病和癌症的发生。因此，MMPs被作为药物靶点。对抗它们失控的活性调节，主要治疗策略是设计针对基质金属蛋白酶催化结构域的药物，这就需要知道具体的结构信息。第一代和第二代抑制剂药物不能够区分开不同的MMPs，导致临床实验失败。近年来的药物设计方法都是开发具高度特异性的抑制剂来针对每个MMP。因此，需知道更多MMPs的结构信息才有助于开发特异药物。MMP-26是MMPs家族的新成员，最先从人子宫内皮肿瘤细胞克隆出来。MMP-26的基因位于11号染色体短臂15.3处，它是MMPs家族中最小的成员之一，具有261个氨基酸。包含信号肽区域、前肽区域和催化结构域。MMP-26缺少血红素样结构域，它在前肽区域具有一个独特的半光氨酸开关序列，PH91CGVPDGSD，91位的氨基酸由保守的精氨酸替换为组氨酸。这个独特的结构导致酶原MMP-26有一个非传统的自激活方式。MMP-26和MMP-7是结构组成上相近两个成员，但它们在细胞内的功能大不相同。MMP-26可以水解很多ECM，包括纤连蛋白、IV型胶原、玻连蛋白、明胶、纤维酶原；同时也可以水解非ECM蛋白，包括胰岛素样结合蛋白1（IGFBP1）和丝氨酸蛋白酶抑制剂（α-1PI）。MMP-26能够激活前体MMP-9，因此可以有效水解ECM，使高度浸润和迁移的前列腺癌细胞（ARCaP）具侵润性。这些结果均表明MMP-26在肿瘤侵润、血管新生和迁移时发挥重要功能。MMP-26的mRNA被发现存在于多个上皮癌细胞中，包括子宫癌、前列腺癌、肺癌，并在它们相应的细胞系和恶性绒毛癌细胞系中表达（JEG3）。MMP-26的mRNA很少在正常的人组织中发现，限制性表达在正常组织，包括胎盘、子宫和肾脏。MMP-26在人前列腺癌中表达量明显提高，这与前列腺炎、前列腺增生和正常前列腺组织的表达量形成明显差距。有趣的是，在原位乳腺导管癌（DCIS）中MMP-26的表达明显高于浸润的导管癌（IDC）、非典型导管上皮增生、邻近DCIS和IDC的正常乳腺上皮细胞。这些结果说明MMP-26参与到人乳腺DCIS的早期侵润和前列腺癌发展到周围基质的过程。由于对MMP-26的研究处于初期阶段，它的生理功能仍是未知的。同时，它也是MMPs家族中的独特成员。MMP-26的三维结构解析的信息还是空白。之前的研究报道显示，MMP-26是在原核大肠杆菌中表达，产生包涵体形式的MMP-26，还需经过变性重折叠过程，才能形成有活性形式。然而，这种表达方式导致低的复性率，只有5-15%的MMP-26会形成正确折叠的活性酶。这种表达方式限制了复性蛋白可做结构研究的基础。目前，MMP-26在大肠杆菌中包涵体表达也存在很多问题。比如，MMP-26的催化结构域单独表达，复性后可能产生无活性的蛋白酶。因为有研究报道称，MMP-26的前肽在表达和复性过程中会起到分子伴侣的作用，帮助其催化结构域正确折叠。此外，酶原MMP-26不会被其它试剂或酶激活，而自激活需要有前肽存在。这种激活方式无法可控，因此得到有酶活性的MMP-26比较繁琐。MMP-26是否可以在原核体系中大量可溶表达？如果MMP-26能够成功大量可溶表达，且折叠正确，具有活性，就可以为其结构研究打开一扇大门。因为从2000年发现MMP-26基因以来，就没有找到一个好的对其进行表达的系统。在目前研究的基础上，我们探索了MMP-26在原核系统的可溶表达。MMP-26酶原和其催化结构域都属于小分子量的蛋白，分别为28kDa和19kDa。由于MMP-26已在原核E. coli表达系统中表达，复性出活性形式，因此可以确定原核系统能够表达出活性形式的MMP-26。本论文的研究就围绕原核系统表达MMP-26展开。首先尝试将酶原形式的MMP-26（ProMMP-26）和其催化结构域（CatMMP-26），用不同的促可溶标签重组融合表达MMP-26，并且在具不同功能E. coli中表达。使用的标签包括6×His，MBP，Trx，SUMO，UBIQUITIN和ELP-INTEIN；使用的E. coli包括BL21(DE3)，Rosetta(DE3)，Rosetta-gami2(DE3)和BLR(DE3)。优化表达条件，取其可溶形式。经诱导表达后的菌体，分为未诱导总蛋白、诱导后总蛋白、可溶部分和包涵体部分。通过SDS-PAGE分析重组MMP-26的表达水平和可溶性。结果发现融合6×His，Trx，SUMO，UBIQUITIN标签在E. coli BL21(DE3)，Rosetta(DE3)，Rosetta-gami2(DE3)中，均不能可溶表达重组MMP-26。虽然融合MBP标签的重组MMP-26能够可溶表达，并且MBP-ProMMP-26/CatMMP-26在E. coli Rosetta(DE3)表达量最高；但是经切割标签后，分离纯化发现表达的重组MMP-26是可溶聚集体形式的蛋白。并且切割标签后产物检测不到酶活性。而融合ELP-INTEIN标签，在E. coli BLR(DE3)可以可溶表达重组的MMP-26，但是表达量极低；利用ELP-INTEIN标签性质无法有效地纯化重组的MMP-26。其实，融合MBP和ELP-INTEIN标签表达的重组MMP-26虽能可溶表达，但是并未正确折叠。经过文献查阅发现短小杆菌（Brevibacillus choshinensis，B. choshinensis）,是一种高效分泌可溶表达重组蛋白的革兰氏阳性菌，这种表达方式使重组蛋白表达产量提高并易于纯化。因为缺少蛋白水解酶，重组蛋白可以在培养基中完整表达，这种表达系统可以促使蛋白形成二硫键。对于某些特定蛋白，这种表达系统优于E. coli。为此，我们尝试用B. choshinensis表达酶原MMP-26（ProMMP-26）和MMP-26催化结构域（CatMMP-26）。在这两种MMP-26蛋白上连接6×His纯化标签，通过在不同培养条件，优化分泌表达。我们成功可溶表达出酶原MMP-26（ProMMP-26）和MMP-26催化结构域（CatMMP-26）。纯化的酶原MMP-26（ProMMP-26），具有明胶酶谱降解活性，并且可以在高浓度下，发生自活化的现象。纯化的MMP-26催化结构域（CatMMP-26），具有高的降解肽底物DQ-gelatin活性，同时也具明胶酶谱降解活性。我们的研究为在原核系统表达天然构象的MMP-26去除了障碍，便利了将来对这种特殊的MMP结构研究。我们发现B. choshinensis分泌表达的MMP-26催化结构域（CatMMP-26-His6）经存放一段时间后，会发生自水解现象。因此我们希望得到稳定的MMP-26催化结构域蛋白。构建了4种MMP-26催化结构域的表达构建体，包括His6-CatMMP-26，His6-CatMMP-26ΔEKCSSDIP+KN， His6-CatMMP-26ΔTSISPGRC，His6-CatMMP-26E209A。这些构建体均把6×His纯化标签放在MMP-26催化结构域的N末端，包括野生型、N末端删除、C末端删除和活性中心点突变。在B. choshinensis成功分泌表达了这些MMP-26催化结构域的构建体。它们的蛋白纯化后均稳定。发现His6-CatMMP-26， His6-CatMMP-26ΔEKCSSDIP+KN，His6-CatMMP-26ΔTSISPGRC都具有降解肽底物DQ-gelatin活性和明胶酶谱降解活性。His6-CatMMP-26和His6-CatMMP-26ΔTSISPGRC降解肽底物DQ-gelatin活性与CatMMP-26-His6水平基本相当，而His6-CatMMP-26ΔEKCSSDIP+KN降解肽底物DQ-gelatin的活性有降低。这些结果，都说明MMP-26的C末端非保守氨基酸具有稳定蛋白构象的作用，在蛋白表达时起到分子伴侣的作用，一旦蛋白折叠完成可以去除，而不影响活性。MMP-26的N末端非保守氨基酸基本不会影响到酶活性中心和蛋白的整体构象稳定。MMP-26催化结构域的Cys97和Cys256并不会影响到到酶活性中心的蛋白构象，从而不会影响其酶活性。总之，本研究在B. choshinensis系统成功分泌表达了酶原MMP-26和MMP-26催化结构域，它们均能正确折叠。同时我们通过删除突变和点突变研究了MMP-26催化结构域的酶活性和蛋白稳定性的关系。