研究背景和目的：中暑(heat stroke)是威胁生命的一种重症疾病,通常由于暴露在高温环境过长而引发,其病理生理特点为快速的核心体温升高超过40℃及高热继发的多脏器功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)。人体临界最高温度为41.6℃～42.0℃。以往有研究表明,中暑可引起广泛的细胞凋亡,热应激可直接诱导细胞损伤和死亡,根据热应激的程度不同,细胞可激活凋亡信号或直接坏死。血管内皮细胞的损伤及活化在中暑的病理生理中发挥着重要作用,其是重症中暑导致MODs的重要原因,在中暑病人中可检测到内皮细胞损伤。最近在我们的研究中,热打击通过转录依赖的线粒体p53路径引起广泛的内皮细胞凋亡。但目前对于内皮细胞凋亡深入的机制研究仍较少,对于热应激诱导内皮细胞凋亡的信号机制有待于进一步阐明。NF-κB是一个重要的细胞内信号转录因子,其控制并参与细胞生长、生存、凋亡和炎症反应。非活性状态的NF-κB位于在细胞质中与抑制性的IκB家族组成复合体,NF-κB的活化依赖IκB家族的磷酸化及降解,其中最主要的是IκBα。 IκBα的降解又依赖于上游IKK激酶的磷酸化,这种激酶主要由两个催化单位构成,即ikkα和ikkβ。活化的NF-κB从NF-κB·IκBα复合体中释放,发生核转位,从而与靶DNA连接发挥其转录活性。NF-κB在调节多种类型细胞凋亡中起着重要作用,其可以通过下调促凋亡的JNK信号通路从而发挥抗凋亡作用。在各种病理情况下,如缺血再灌注,ROS的过度累积可激活下游的MAPK家族,caspase级联反应及线粒体膜电位受损。NF-κB也可通过抑制TNF-α诱导的ROS介导的MAPK活化及坏死性细胞凋亡在小鼠的成纤维细胞中发挥抗凋亡作用。然而,ROS在热应激诱导的MAPK活化中起怎样的作用及NF-κB的活化是否通过ROS介导MAPK信号转导通路从而调控凋亡尚未有研究报道。热休克蛋白(HSP)是进化上保守的一组蛋白,其介导的细胞对抗热应激的反应,在各种应激情况下热休克蛋白的表达可保护细胞免于细胞损伤(包括细胞凋亡和坏死)。特别是对HSP27及HSP70的研究,大量文献文明HSP27和HSP70有助于NF-κB的活化。HSP27对NF-κB信号传导途径的连接对调控细胞凋亡起一定的联系。例如,在白细胞介素1β(IL-1β)刺激的肠上皮细胞中,HSP27被证实可与IKK结合从而抑制NF-κB的活化。类似机制在肿瘤坏死因子(TNF-α)和UV照射刺激的角质细胞及TNF-α刺激HeLα细胞中被证实。此外,各种刺激下HSP27表达增加,其可使蛋白酶体介导的IκBα更易发生磷酸化,并发生降解从而促进NF-κB活性,HSP27最终起着抗凋亡作用。为了研究HSP27是否对热应激情况下NF-κB的活化起调控作用,从而最终发挥其抗凋亡作用为本研究主要研究内容。在本研究中我们选用分离人脐静脉内皮细胞建立热应激模型,NF-κB信号通路在热应激的内皮细胞中发挥着新的作用,其包括调控HSP27蛋白的表达和转移至细胞核内,ROS在细胞内的累积,及下游的MAPK家族激活。综上所述,本研究目的在于探讨热打击诱导内皮细胞凋亡的具体机制,阐明介导热打击诱导细胞凋亡的信号通路、上游信号分子以及中间环节各信号分子之间的相互作用,从分子水平上了解热打击诱导内皮细胞凋亡机制,为揭示中暑内皮细胞介导的病理过程奠定基础,也为临床中暑预防和治疗提供理论依据。主要方法和结果：1.分离人脐静脉内皮细胞并建立热应激模型,热应激恢复期NF-κB是否发生活化及其具体其活化机制按照参考文献分离人脐静脉内皮细胞并用用VE-cadherin和VEGFR-2鉴定细胞表型。43℃,90min热打击后不同复温时间点(0、2、6、12 h)及37℃对照组细胞,使用荧光显微镜观察NF-κBp65的定位。并提取胞浆胞核蛋白,使用Western blotting定量分析其在核内水平,使用试剂盒检测NF-κBp65的DNA连接活性。Western blotting检测IKK-α/β、IκB-α、p65表达及磷酸化水平变化。热应激早期并不能使NF-κB发生活化,随着恢复期延长NF-κB可发生活化,热打击早期及恢复期并不能使得IKK-a/β发生磷酸化,但IκB-a在热应激早期及恢复期均发生磷酸化,但未发生降解。p65在热应激早期未发生磷酸化,但在恢复期可被激活从而发生磷酸化修饰。构建IκB-a磷酸化位点的抑制性突变从而抑制其磷酸化,其并未改变热应激恢复期12 h p65磷酸化水平,也未改变p65的核转位。热打击恢复期IκB-a同p65一起发生核转位,同时我们使用小分子干扰RNA敲除p65,发现在热应激恢复期(2、6、12 h)IκB-a表达水平也发生降低,使用免疫共沉淀,发现正常及热应激情况下IκB-a同p65均未发生解离,在热应激时一齐转入到核内共同调控基因表达,同时使用LPS刺激内皮细胞作为阳性参照,使用LPS刺激后IκB-a可与p65发生解离。以上结果表明,热应激可激活NF-κB信号路径,其活化的机制区别于经典的路径,其不依赖于上游的IKK-α/β复合体的活化及IκB-α的磷酸化和降解,在热应激后IκB-α与p65并未发生解离,而是与p65一起转入核内调控基因的转录。热应激导致NF-κB的活化可能与其自身的热敏性有关。2. NF-κBp65及HSP27蛋白在所建立的热应激内皮细胞模型中产生相互作用共同介导抗凋亡功能使用NF-κB活化抑制剂BAY11-7082,或使用p65-siRNA降低细胞p65蛋白的表达,热打击抑制剂预处理的细胞及p65-siRNA转染的细胞。结果显示使用抑制剂BAY11-7082或p65-siRNA明显增加了热打击诱导的细胞凋亡,同时也增加了热打击诱导Caspase-3的活化。分别使用小分子干扰RNA降低HSP27表达及腺病毒过表达HSP27,给予43℃,90 min热应激后恢复期12h流式细胞仪检测细胞凋亡情况,HSP27siRNA处理的细胞凋亡数目明显增加,Caspase-3的活化程度增加,Ad-HSP27预处理的细胞凋亡数目显著降低,Caspase-3的活化程度也发生降低。这一结果说明了NF-κB和HSP27在热应激致内皮细胞凋亡中起着抗凋亡的作用。为进一步研究两者关系,使用荧光显微镜观察正常及热应激情况下p65及HSP27在细胞内的分布情况,结果显示正常情况下p65及HSP27都处于细胞浆分布,当给予43℃,90min热应激恢复期12 h p65及HSP27主要分布在细胞核中。给予NF-κB活化抑制剂BAY11-7082预处理细胞,热应激恢复期12 h, BAY11-7082预处理组细胞p65核转位明显减少,同时HSP27在核内的累积也发生减低。故推测p65与HSP27之间可能存在相互作用,使用免疫共沉淀,发现在正常情况下,p65与HSP27存在连接,给予热应激后两者产生相互作用共同转移到核内。使用小分子干扰RNA降低HSP27的表达明显降低NF-κB p65的DNA转录活性,使用腺病毒过表达HSP27并未对NF-κB p65的DNA连接活性产生明显影响,其可能与热打击本身可使HSP27表达升高,故热应激后HSP27与p65作用位点已经饱和,故给予过表达并不能得出显著结果。同时我们使用NF-κB活化抑制剂BAY11-7082,或使用p65-siRNA降低细胞p65蛋白的表达,Western blotting检测热应激恢复期(2、6、12 h) HSP27蛋白表达。结果显示给予BAY11-7082预处理的细胞在热应激恢复期12 h HSP27表达水平较DMSO预处理组明显降低,使用p65-siRNA处理的细胞在热应激恢复期6h及12 h HSP27表达水平较NCsiRNA处理组明显降低,表明NF-κB活化可能对HSP27的表达起着调控作用。我们进一步分析了NF-κB活化是否对HSF-1表达及活化产生影响从而对HSP27的表达起着间接作用。人脐静脉内皮细胞给予43℃热应激,Western blotting检测其热应激过程中及其恢复期(15,30,60 min, R2, R6, R12 h) HSF1表达及磷酸化情况,同时提取胞浆胞核蛋白Western blotting检测热应激恢复期(0、2、6、12 h) HSF1的核转位情况。结果显示热应激早期15 min HSF1即已发生磷酸化,持续至恢复期6h,直至恢复期12h恢复至基础水平,而HSF1表达水平并未升高反而发生降低,其分子量较正常升高,正常情况下HSF1在胞浆内呈单体状态,给予热应激后单体汇合形成三聚体,转移到核内调控热休克蛋白的转录,故热应激后HSF1分子量较正常大,故在Western blotting图中条带位置显示较高。给予热应激后,HSF1可发生核转位,恢复期0-2 h较为显著,恢复期6-12h HSF1在核内的累积发生明显下调。给予HSF1siRNA降低HSF1表达及Ad-HSF1对HSF1过表达,Western blotting验证其转染效果及HSP27表达情况,在正常及热应激情况下,HSF1均可对HSP27表达起调控作用。我们使用p65siRNA检测其在热应激情况下对HSF1核转位及磷酸化的影响,结果显示p65siRNA处理细胞在热应激恢复期6h并不影响HSF1的核转位,同时p65siRNA处理的细胞在热应激恢复期(2、6、12 h)对HSF1的磷酸化水平也未产生明显作用。故NF-κB活化对HSP27表达的影响可能并非通过与HSF1直接作用,我们推测NF-κB对HSP27的表达可能有着直接调控作用。我们使用CHIP检测试剂盒检钡NF-κBp65在HSP27启动子区域是否存在结合位点,同时使用HSF1作为阳性参照来验证整个CHIP系统是否有效。结果显示HSF1在正常及热应激情况下在HSP27启动子区域都存在结合位点并对HSP27表达起调控作用,而NF-κBp65在HSP27启动子区域并未发现结合,但我们使用RNApolⅡ文献中报道其含有NF-κBp65的转录结合位点,发现其与HSP27启动子结合增多,我们将NF-κBp65敲除后,发现RNA polⅡ对HSP27启动子结合明显降低,从而我们从侧面可得出NF-κBp65对HSP27在转录水平上可能起着调控作用。3. NF-κB p65通过抑制热应激致ROS在内皮细胞内累积,从而抑制下游MAPKs家族活化,最终起着抗凋亡作用。提取热应激不同时间及热应激90min后不同复温时间点(0、2、4、6、12、24 h)和37℃对照组的HUVEC细胞总蛋白,Western blot方法分析MAPK家族活化情况；结果表明热应激早期ERK、p38在热应激15 min即可发生磷酸化,JNK在热应激60 min发生磷酸化,在热应激恢复期MAPKs家族磷酸化被快速诱导,热应激恢复期4h仍维持在高水平,6h开始降低至基线水平,我们给予NF-κB活化抑制剂BAY11-7082及SN50预处理细胞,热应激恢复期6h时间点提取蛋白MAPKs家族活化,结果显示给予抑制剂处理组MAPKs活化时间延长且活化强度增加,同时我们使用p65siRNA处理细胞检测热应激恢复期(2、6、12h) MAPKs家族活化情况,结果表明p65siRNA处理组细胞MAPKs家族活化强度较NCsiRNA处理组增加。故NF-κB活化可介导MAPKs的强度增加及时间延长。给予ROS清除剂APO预处理细胞,检测不同时间点(15、30、90min) MAPKs家族活化情况。结果显示APO可抑制MAPKs家族的活化,但这种作用并不完全,给予MAPKs家族活化抑制剂处理细胞,其与DMSO预处理组相比并未增加ROS水平,故MAPKs家族处于ROS的下游。我们给予NF-κB活化抑制剂BAY11-7082及SN50,或使用p65siRNA处理细胞热应激恢复期6h流式细胞仪检测ROS产生情况,其ROS产生水平显著高于对照组。同时p65siRNA处理细胞检测热应激后恢复期6h线粒体损伤情况,结果显示热应激可使线粒体发生损伤,从而线粒体膜电位下降,p65siRNA处理组线粒体膜电位下降更显著。线粒体是ROS产生的主要场所,我们的结果表明NF-κB活化可保护线粒体免于热损伤从而降低ROS的产生及ROS介导的MAPKs家族的活化。同时我们使用ROS清除剂APO及NAC预处理细胞检测热应激恢复期12h内皮细胞凋亡情况,结果表明经APO及NAC预处理的细胞凋亡明显降低,经APO预处理的细胞其Caspase-3活性明显降低。使用ERK活化抑制剂PD98059、JNK抑制剂SP600125及p38活化抑制剂SB203580预处理细胞,Western blot方法验证抑制剂效果,流式细胞术检测细胞凋亡情况,SP600125及SB203580预处理细胞后其凋亡数目较DMSO对照组明显降低,而PD98059预处理细胞组较DMSO对照组凋亡数目明显增多。以上结果表明热应激使ROS在胞内过度累积从而导致凋亡发生,p38及JNK在热打击内皮细胞模型中起着促凋亡作用,ERK起着抗凋亡的作用。结论1.热应激可使NF-κB发生活化,其活化的机制为非经典途径,其不伴有IκB-α的解离与降解,而是与p65一起转入核内调控基因的转录。NF-κB的活化可能与其自身的热敏性有关。2. NF-κBp65及HSP27蛋白在所建立的热应激内皮细胞模型中起着抗凋亡的作用。在正常情况下NF-κB p65与HSP27在胞浆内分布并存在连接,在给予热刺激后两者一起转入核内,热应激致HSP27表达增加及核转位其可使NF-κB p65维持其转录活性,同时NF-κB p65对HSP27可能存在转录调节作用。3. NF-κB p65作为上游抑制热应激致ROS在内皮细胞内累积,从而抑制下游MAPKs家族活化,最终起着抗凋亡的作用,但这种作用并不完全；热应激使ROS在胞内过度累积从而导致凋亡发生,p38及JNK在热打击内皮细胞模型中起着促凋亡作用,ERK起着抗凋亡的作用。