1背景肝郁脾虚证又名肝脾不调证是由肝失疏泄,脾失健运,以胁胀作痛,腹胀食少,情绪抑郁,便溏不爽,或腹痛欲便、泻后痛减,脉弦缓等为常见症的证候。“百病生于郁”,肝郁脾虚证是中医临床众多常见病(肠易激综合征、功能性消化不良、溃疡性结肠炎、慢性乙型肝炎、脂肪肝、乳腺增生、甲状腺功能障碍、抑郁症、亚健康等)及疑难病早期(多囊卵巢综合征、甲状腺恶性肿瘤、子宫恶性肿瘤等)的常见证候。逍遥散方出自宋代《太平惠民和剂局方》,脱胎于张仲景四逆散、当归芍药散之法,是解郁的经典名方之一,经过历代医家的应用,至今可以拓展应用于临床内、妇、儿、男、五官等各科。“方证相关”是指一个方剂的制方要素(药味、药量、剂型、用法)与其所主治的病证(方证)病机(病因、病性、病位、病势)之间存在高度的关联或应对性。课题组前期针对逍遥散长达20余年的研究发现:逍遥散方的配伍、功效与肝郁脾虚证的主症甚至兼症、病机及其演化过程存在高度的针对性和统一性。因此,进一步深入开展肝郁脾虚证-逍遥散(方证)的生物学内涵研究对于临床很多常见病、某些疑难杂病的中医诊断、辨证以及中医药精准治疗具有重要意义。中医证候动物模型是中医理论、中医证候、中医药复方、中医药特色疗法等中医理、法、方、药各个环节现代化研究的基础。目前肝郁脾虚证动物模型大多数采用的是单纯性病因(情志刺激)或复合型病因病理造模方式,模型的评价手段单一、片面,造成建立的模型在可靠性、可重复性以及临床适用性等方面并不理想。系统生物学是利用整体性、系统性的研究手段来解析复杂生命过程的一门新兴学科。系统生物学整体、动态、层次及整合的分析思路和中医证候整体、恒动、系统的特征相吻合,因此将系统生物学引入中医证候生物学基础研究意义重大。全基因组DNA甲基化属于系统生物学中表观遗传学分支的一个热点研究。DNA甲基化可以实现对DNA进行相对稳定并可遗传的表观修饰,能够调控基因转录,从而引起基因沉默。然而,目前国内外研究肝郁脾虚证-逍遥散(方证)的全基因组DNA甲基化变化及其调控尚处于空白阶段。下丘脑在维持机体能量代谢生理活动中发挥着关键性作用,下丘脑多个核团特别是弓状核在能量摄入和支出平衡过程中起着重要的作用。同时,弓状核还通过广泛接受来自杏仁核、脑干、皮层以及下丘脑内部大多数核团的神经传入,从而积极参与认知、学习记忆、奖赏、情绪等行为。课题组前期研究发现弓状核促食欲-抑食欲神经肽紊乱可能是肝郁脾虚证出现摄食失调的内在机制及逍遥散调控靶点之一。然而,近年来越来越多的研究报道了:抑郁情绪与糖、脂质以及胰岛素代谢的密切关系,这表明糖、脂质及胰岛素等能量代谢紊乱是情志不畅(肝郁)诱导的摄食异常(脾虚)的深层次机制。因此,本课题拟结合前期工作基础,首先建立稳健的肝郁脾虚证动物模型,在此基础上,借助全基因组亚硫酸测序(Whole genome bisulfite sequencec,WGBS)技术,选取下丘脑弓状核为研究部位,围绕肝郁脾虚证情志不畅导致摄食失调的肝郁脾虚证核心病机环节,进一步揭示肝郁脾虚证的证候病机生物学内涵及逍遥散的治疗机理。2方法本研究主要由三部分实验组成。第一部分:实验一:100只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、氟西汀组(2.0mg/kg/d)、归脾丸组(4.6275g/kg/d)和逍遥散组(2.224g/kg/d),每组 20 只。除正常组外,其余各组大鼠每天束缚3小时连续束缚21天。在造模的同时,各给药组分别预防性灌服氟西汀、归脾丸和逍遥散进行治疗。造模结束后采用旷场、强迫游泳、糖水消耗、下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamus pituitary adrenal axis,HPA)(应激轴)来评价各组大鼠的“肝郁”行为;采用体重、摄食量、体脂率、小肠推进率、粪便含水率、内脏高敏感性、D-木糖排泄率来评价各组大鼠的“脾虚(肝郁所致)行为;并通过逍遥散(方证对应)和归脾丸(方证不对应)的治疗效果来反证模型。实验二:100只SD雄性大鼠随机分为正常组、3周模型组、4周模型组、6周模型组和8周模型组,每组20只。除正常组外,其余各组大鼠分别进行3周、4周、6周、8周的慢性不可预知温和应激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)造模。造模结束后,采用实验一中评价“肝郁”和“脾虚(肝郁所致)”行为的方法评价模型。实验三:在实验二基础上,重新纳入100只SD雄性大鼠,随机分为正常组、模型组、氟西汀组、归脾丸组和逍遥散组,每组20只。除正常组外,其余各组大鼠进行6周的CUMS造模。在造模的同时,各给药组分别预防性灌服氟西汀(2.0mg/kg/d)、归脾丸组(4.6275g/kg/d)和逍遥散组(2.224g/kg/d)进行治疗。造模结束后,采用实验一中评价“肝郁”和“脾虚(肝郁所致)”行为以及药物反证的方法综合评价模型。第二部分:在实验三基础上,采用WGBS方法及生物信息学方法检测正常组、模型组和逍遥散组三组大鼠下丘脑弓状核的全基因组DNA甲基化谱及其调控的靶基因。第三部分:在第二部分的基础上,采用实时荧光定量PCR方法对DNA甲基化调控的候选靶基因(Slc2a4、Nmur2、Irx3、Irx5、Bmp4、Nkx2-1、Glp1r、Ankrd26、Fads2、Mlycd、Gpr26、Angptl4、Prkaca、Drd1、Grm5)进行验证。3结果第一部分:实验一结果发现:模型大鼠仅仅在强迫游泳实验、体重和摄食量检测中与正常组存在显著差异,同时逍遥散治疗作用并不明显,表明当样本量扩大时,21天慢性束缚应激方式建立的肝郁脾虚证大鼠模型的稳定性并不高。实验二结果发现:3周、4周、6周和8周CUMS造模均能够成功建立抑郁症疾病模型;而旷场、强迫游泳、糖水消耗、HPA轴(应激轴)、体重、摄食量、体脂率、小肠推进率、内脏高敏感性等综合评价结果表明6周的CUMS造模可能是抑郁症处于肝郁脾虚证候阶段的时间窗。实验三结果发现:6周CUMS造模大鼠在旷场和强迫游泳实验中表现出明显的抑郁行为,而氟西汀、归脾丸和逍遥散的治疗能够明显逆转这一抑郁行为;6周CUMS造模能够明显减少大鼠的体重,氟西汀和逍遥散能够在实验后两周起到改善体重的作用;6周CUMS造模能够明显减少大鼠的摄食量,逍遥散能够在实验后前两周起到改善摄食量的作用;6周CUMS造模能够明显增加大鼠的内脏敏感性,氟西汀和逍遥散的治疗能够很好地降低模型大鼠的内脏敏感性;此外,综合三个实验的结果,我们还发现既往研究中采用的HPA轴(评价肝郁)、粪便的含水率(评价脾虚)、D-木糖排泄率(评价脾虚)的评价方法对肝郁脾虚证大鼠模型的评价价值并不大。第二部分:全基因组亚硫酸氢盐测序法检测各组大鼠下丘脑弓状核全基因组DNA甲基化谱及其调控。Profiling分析结果显示:各组在CG位点TSS区段前后的甲基化水平存在显著差异。CG位点差异甲基化区域(Differentially methylated region,DMRs)分析结果显示:共发现了 30395个DMRs(模型组比正常组)和40164个DMRs(逍遥散组比模型组),且这些DMRs经注释后共有13346个DMRs(模型组比正常组)和19934个DMRs(逍遥散组比模型组)和3055个Share DMRs(模型组比正常组和逍遥散组比模型组合集);在这些Share DMRs里共有486个DMRs落在转录起始位点(Transcription start site,TSS)区段。Share DMRs注释甲基化水平结果显示:模型组发生高甲基化的DMRs要明显多于正常组和逍遥散组,模型组发生低甲基化的DMRs要明显少于正常组和逍遥散组。TSS区段的Share DMRs的GO分析结果显示:这些差异甲基化位点调控转录的候选基因主要参与了甲状腺激素刺激的反应、垂体发育、G蛋白偶联受体信号通路、突触长时程增强、细胞发育、学习、神经元分化、蛋白酶活性、大脑发育、细胞应对胰岛素刺激反应等生物过程,定位于染色质、髓鞘、线粒体、神经肌肉接点、内质网、转录因子、高尔基体、细胞外基质等细胞组分,具有蛋白连接、转化生长因子β受体连接、转录因子活性、连接酶活性、氧化还原酶活性、生长因子活性、微管结合等分子功能。TSS区段的Share DMRs的KEGG分析结果显示:这些差异甲基化位点调控转录的候选基因主要参与甲状腺激素信号通路、细胞凋亡、AMPK信号通路、TCA cycle、胰岛素信号通路、脂肪酸合成、帕金森病、ABC转运蛋白、Notch信号通路、糖代谢以及2型糖尿病等信号和疾病通路。其中,我们特别关注了涉及摄食、脂肪、胰岛素及情绪行为信号通路密切相关的候选基因包括,Slc2a4、Nmur2、Irx3、Irx5、Bmp4、Nkx2-1、Glp1r、Ankrd26、Fads2、Mlycd、Gpr26、Angptl4、Prkaca、Drd1 及 Grm5,这些候选基因可能是肝郁脾虚证情绪不畅,食欲不振病机环节和逍遥散调控的DNA甲基化标记及其调控的靶基因。第三部分:实时荧光定量PCR验证结果显示:模型大鼠下丘脑弓状核Slc2a4 mRNA表达水平明显低于正常组,Nmur2 mRNA表达水平显著高于正常组,而逍遥散的治疗能够显著逆转模型大鼠能量代谢相关基因Slc2a4和Nmur2mRNA的表达,这一结果与其甲基化调控转录一致;模型组大鼠下丘脑弓状核Irx3和Irx5mRNA表达水平显著低于正常组,而逍遥散能够显著上调其表达,这一结果与其甲基化调控转录相反;各组大鼠下丘脑弓状核的 Bmp4、Nkx2-1、Glp1r、Ankrd26、Fads2、Mlycd、Gpr26、Angptl4、Prkaca、Drd1及Grm5 mRNA表达未见显著差异。4结论采用CUMS造模方式建立的抑郁症大鼠模型出现肝郁脾虚证证候阶段的时间窗为6周,且6周CUMS建立的抑郁症肝郁脾虚证病证结合大鼠模型的相似性、可重复性和效应性较高,可以推广运用于肝郁脾虚证现代生物学基础研究以及临床诊断治疗等方面。在此基础上,我们发现下丘脑弓状核差异甲基化调控的候选靶基因Slc2a4和Nmur2可能是肝郁脾虚证情志不畅、食欲不振核心病机环节的生物标志物及逍遥散的调控靶点,为深化肝郁脾虚证-逍遥散(方证)理论认识和辨证论治个体化诊疗提供了实验依据。