论文部分内容阅读
目的构建稳定表达PNPLA3基因野生型和PNPLA3基因I148M突变型的Huh-7细胞株,在此基础上探讨PNPLA3基因I148M多态性对人Huh-7细胞周期的影响及相关机制。方法双酶切PNPLA3基因野生型及PNPLA3基因I148M突变型的基因序列与载体序列,并使目的基因分别与载体连接,纯化并扩增获得含有目的基因的载体质粒;获得的载体质粒和病毒辅助包装质粒共转染293T细胞,获得携带目的基因的高滴度的慢病毒;慢病毒转染Huh-7细胞,筛选并构建稳定表达PNPLA3基因野生型和PNPLA3基因I148M突变型的Huh-7细胞株;在此基础上以空载体Huh-7细胞为对照,流式细胞术检测转染的Huh-7细胞周期,Western blot方法及荧光定量PCR分别检测细胞周期调节因子Cyclin D1及p53的表达情况。统计学处理采用SPSS 17.0软件,定量资料的数据均以“均数±标准差”表示,两组间比较分别采用独立样本t检验或χ2检验;P<0.05为差异有统计学意义。结果(1)成功构建载体质粒:阳性克隆菌液进行测序,测序结果证实载体质粒携带目的基因完整编码序列。(2)慢病毒载体构建成功并获得足够滴度(1×10^8PFU/ml)的慢病毒载体:倒置荧光显微镜下显示携带目的基因的慢病毒载体在293T细胞中成功组装,嘌呤霉素筛选后表达出明亮的绿色荧光蛋白。(3)慢病毒成功感染Huh-7细胞:倒置荧光显微镜下显示嘌呤霉素筛选后绿色荧光蛋白阳性表达率>95%;Western blot结果显示突变型组与野生型组目的蛋白的表达明显高于对照组;荧光定量PCR结果显示突变型组及野生型组PNPLA3 mRNA的相对表达(突变型166.65±117.25,野生型1149.55±278.17)分别明显高于对照组(1.02±0.23,P<0.05)。(4)PNPLA3基因I148M多态性导致Huh-7细胞周期紊乱:三组间各细胞周期细胞所占比例(%)的两两比较显示野生型组细胞周期G1期(58.53±0.35),G2/M期(24.87±0.60),S期(16.60±0.26)参数与对照组对应各期(G1期59.27±0.15;G2/M期24.23±0.31;S期16.50±0.26)之间差异无统计学意义;突变型组与野生型组相比,G1期细胞比例减少(突变型G1期38.37±0.21,P<0.05),S期与G2/M期细胞比例相应增加(突变型S期27.47±0.35,G2/M期34.17±0.15,P<0.05)。(5)周期相关蛋白P53表达显著增强,Cyclin D1表达水平无明显差异:与对照组相比,突变型组的P53 mRNA相对表达量明显上调(对照组1.06±0.41,突变型组6.54±0.34;P<0.05);野生型组P53 mRNA相对表达量差异无统计学意义(1.66±0.30,P>0.05)。Cyclin D1 mRNA各组中的相对表达量均无明显差异(对照组1.00±0.10,野生型组1.06±0.03,突变型,1.11±0.04;P>0.05)。结论PNPLA3基因I148M突变可能促进Huh-7细胞DNA的复制,加速细胞周期,从而促进肝癌细胞生长。上调p53的表达参与了此过程。