用于细胞体外培养的聚乙烯醇水凝胶力学性能模拟及定量控制

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近年来,细胞所处环境的微观力学状况对细胞生物学行为的影响受到广泛关注。对在体具有锚着依赖生长特性的绝大多数组织细胞而言,其粘附基底的硬度可影响细胞的多种生物学行为,如细胞形态调整、迁移取向变化、以及增殖和分化改变等,而这些生物学行为与许多生理、病理过程密切相关。构建模拟在体细胞生长环境的体外细胞培养模型需要解决两方面的问题即生物化学环境和生物物理环境的构成解析,前一部分工作由生物学家和医学家的努力而逐渐完善,而生物物理因素的影响首推基底硬度的作用,其中对细胞生长基底的力学性能模拟及定量控制又是这一部份工作的核心。水凝胶是一种水溶性聚合物,其含水率与人体环境中器官、组织的大分子极为相似,相对于其它材料,具备更好的生物相容性,目前已广泛用于生物医学材料。本研究采用化学交联法制备聚乙烯醇(PVA)水凝胶,并以此作为体外培养细胞的基底,用以研究细胞对基底力学环境的响应规律。使用戊二醛作为化学交联剂制备出了饱和聚乙烯醇水凝胶膜,其具有机械强度高及热稳定性好的特点。另外,少量戊二醛还有消毒灭菌的效果,能够清洁细胞生长环境。由戊二醛交联制备的PVA水凝胶在作为细胞体外培养的基底材料方面有着广泛的应用前景。由Flory-Huggins理论知,交联度决定材料的平衡含水率(EWC),EWC是影响杨氏模量(E)的直接因素。由于实际反应后的交联度测量困难,传统方法以交联剂与单体的摩尔比(d)代替交联度,计算出来的水凝胶杨氏模量值与实际测量值之间存在很大偏差。加之,水凝胶中水的自重变形会严重干扰模量的准确测定。所以直到目前为止,水凝胶力学性能都是采用经验的、没有任何数学规律可寻的数据点图来控制,偏差大且不易操作。本文的改进主要在于:第一,改变了简单的以交联剂与单体的摩尔比(d)代替交联度的传统做法。单体初始浓度(C0)和d影响凝胶的交联度,从C0、d出发,分析C0、d与EWC及E的函数关系,及EWC对E的影响,利用回归分析建立了相关的数学模型。第二,客观规律能否在试验点中呈现出来,所采数据样本的准确性是十分重要的因素,这是数学模拟得以实现的关键。因此本文对传统的杨氏模量拉伸测量法予以改进,创建了一种新的水凝胶弹性模量测量方法,使得测量结果更准确。实验数据与计算结果表明:以上两点改进,使建立的数学模型能很好地模拟水凝胶的弹性模量E与C0、d及EWC的关系,实现了对聚乙烯醇水凝胶力学性能的模拟与定量控制。分别取杨氏模量值为3.6kPa,10kPa及30kPa模拟肝纤维化病变过程中肝脏组织的硬度,研究了L02细胞在不同硬度基底上形状调整和骨架发育等行为。通过Image J软件测量细胞的铺展面积、细胞圆度值(CF),发现细胞更倾向于在硬基底上铺展,在软的基底上,细胞的形态更趋近于圆形。对不同硬度基底上细胞骨架构象的免疫荧光观察,结果显示在硬基底上的细胞骨架装配完整,内部形成纤维束,细胞周围长出应力纤维,而在软基底上,细胞的F肌动蛋白主要沿细胞膜分布。细胞骨架张力也会受到基底硬度的调控,随着基底硬度的增加,骨架张力变大。
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