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【研究目的】肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其高发病率和高致死率的主要原因是血管侵犯和转移。因此对于肝癌转移和肿瘤血管生成的研究将更好地提升肝癌的抗血管治疗效果。Amotl2(Angiomotin like protein-2)是Amot家族成员之一,目前仍不清楚Amotl2的作用和分子机制。本实验检测肝细胞肝癌中Amotl2、上皮间充质转变(epithelial-mesencheymal transition,EMT)相关分子E-cadherin、血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)形成的标记蛋白VE-cadherin的表达情况并探讨它们之间的关系;然后分析Amotl2的表达与年龄、性别、肿瘤大小及临床分期等各种临床资料的关系;探究Amotl2与VM两者对于肝细胞肝癌(HCC)的生存时间及临床预后的影响,从而更好地阐述Amotl2对于肝细胞肝癌VM形成、转移及预后的影响和意义。同时在体外实验中观察Amotl2对于肝癌细胞的成管、侵袭和迁移能力的影响,进而了解其对于肿瘤细胞的转移能力及VM形成的影响。总之,对于Amotl2在肝细胞肝癌中的表达和VM形成等肿瘤微环境变化以及临床预后的影响的初步研究,将会为肝细胞肝癌的诊断治疗寻找到潜在的靶点,为肝细胞肝癌的靶向治疗提供一定的借鉴。【研究方法】1、收集天津市肿瘤医院经手术切除且随访资料完整并经病理诊断为肝细胞肝癌的病例标本89例,利用免疫组织化学方法染色分析,观察血管生成拟态(VM)的存在与否及其与临床预后之间的关系;分析Amotl2与VM、年龄、性别、肿瘤大小、病理分级、临床分期、转移之间的关系;将病例分为原发性肝癌组(Ⅰ-ⅢA期)、肝癌门脉癌栓组(ⅢB期)和肝癌远处转移组(ⅣB期),观察三组之间Amotl2的表达情况以及组间差异与临床预后之间的关系;初步分析上皮间充质转化(EMT)相关蛋白(E-cadherin、VE-cadherin)和VM相关蛋白(CD31/PAS、MMP2)与Amotl2之间的关系。以及Amotl2阳性、VM阳性对临床预后的影响,筛选与VM关系密切的EMT相关蛋白,为肿瘤细胞向血管内皮方向塑形研究提供依据。用Kaplan-Meier生存分析比较Amotl2阳性组和Amotl2阴性组患者的生存预后情况。2、根据Amotl2的表达水平,选取低表达Amotl2的HCC细胞系Hep G2细胞和高表达Amotl2的HCC细胞系Bel7402细胞。Hep G2细胞转染Amotl2上调质粒构建Amotl2上调模型,Bel7402细胞转染Amotl2下调质粒构建Amotl2下调模型。利用Western Blot鉴定Amotl2转染效果。3、利用划痕和侵袭实验评价上调Amotl2对Hep G2细胞侵袭迁移能力变化的影响;下调Amotl2对Bel7402细胞侵袭迁移能力变化的影响。4、在三维培养体系中分别上调Amotl2,观察其对Hep G2细胞管状结构形成能力的影响;下调Amotl2,观察其对Bel7402细胞管状结构形成能力的影响。5、利用Western Blot实验检测上调Amotl2对Hep G2细胞中EMT相关蛋白(E-cadherin、Vimentin)表达的影响;下调Amotl2对Bel7402细胞中EMT相关蛋白(E-cadherin、Vimentin)表达的影响。【研究结果】1、免疫组化染色结果显示,在89例肝癌标本中,49例呈Amotl2阳性表达,40例呈Amotl2阴性表达。分析Amotl2阳性组和Amolt2阴性组与肝癌患者临床病理资料的关系显示,Amotl2与VM呈正相关(c2=5.662,P=0.017)。Amotl2在年龄>45岁的患者中表达较高,而在≤45岁的患者中表达较低(c2=8.400,P=0.004)。Amotl2在不同病理分级的患者中表达不同,Amotl2在低分化的患者中表达高于高分化的患者(c2=4.048,P=0.044)。Amotl2在不同临床分期的患者中表达也不同,肝癌原发癌组(Ⅰ-ⅢA期)、肝癌门脉瘤栓组(ⅢB期)和肝癌远处转移组(ⅣB期)三组之间Amotl2的表达量差异具有统计学意义(c2=5.575,P=0.019)。Amotl2在不同性别、肿瘤大小、有无转移的患者中差异无统计学意义(P>0.05)。Kaplan-Meier生存分析结果显示,Amotl2阳性组较Amotl2阴性组患者的生存时间短(P=0.046)2、统计学分析表明,Amotl2与肝癌中VM呈正相关,本研究发现,49例Amotl2阳性组中有12例VM阳性,而Amotl2阴性组中仅有4例VM阳性(r=0.277,P=0.009),提示Amotl2与VM密切相关,即Amotl2在VM阳性组的表达率明显高于在VM阴性组的表达率。本研究发现,49例Amotl2阳性组中有30例VE-cadherin阳性,而Amotl2阴性组中仅有2例VE-cadherin阳性(r=0.631,P=0.000),说明Amotl2与VM相关蛋白VE-cadherin密切相关。本研究发现,虽然在89例病例中Amotl2与MMP2关系不密切,但是在远处转移组中19例Amotl2阳性组中有10例MMP2阳性,Amotl2阴性组中仅有1例MMP2阳性(r=0.418,P=0.024),两者关系密切。3、Western Blot实验显示转染Amotl2上调质粒后Hep G2细胞Amotl2表达明显上调,转染Amotl2下调质粒后Bel7402细胞Amotl2表达明显下调。4、划痕和侵袭实验结果显示,上调Amotl2后,Hep G2细胞迁移侵袭能力明显提高(P<0.05);下调Amotl2后,Bel7402细胞迁移侵袭能力明显降低(P<0.05)。5、三维培养结果显示,上调Amotl2后,Hep G2细胞形成管状结构的能力明显增强;下调Amotl2后,Bel7402细胞形成管状结构的能力明显降低。6、Western Blot结果显示,上调Amotl2后,Hep G2细胞中EMT相关蛋白Viementin表达增强,E-cadherin表达降低;下调Amotl2后,Bel7402细胞中EMT相关蛋白Viementin表达降低,E-cadherin表达增强。【研究结论】1、Amotl2表达增加与肝癌的VM、年龄、病理分级、临床分期呈正相关,与其他临床病理资料无关,并且Amotl2表达阳性的患者生存时间短,预后不良。2、Amotl2可以增强HCC细胞的迁移、侵袭能力和VM形成能力,Amotl2基因可能通过诱导HCC细胞发生EMT来促进肝癌VM形成。本研究可能为肝癌的抗血管治疗提供了新的作用靶点。