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随着生活节奏加快和工作压力增大,越来越多的人群受到精神压抑、内分泌失调等问题的困扰。流行病学分析表明长期心理压力与癌症患者的不良预后呈正相关。虽然已经明确神经内分泌系统对肿瘤发生、发展的重要调控作用,但由于神经、内分泌系统的复杂性,其在肿瘤发生、发展及肿瘤免疫微环境调控中的功能和机制还亟待进一步探究。为了探究精神异常对免疫系统的影响,本课题首先采用急性束缚(acute restraint,AR)构建小鼠慢性精神压力模型,并对其脾脏中免疫细胞的变化进行分析。结果表明:急性束缚未显著影响树突状细胞(dendritic cells,DCs)和巨噬细胞的比例,但明显降低脾脏中央记忆型T细胞和效应记忆型T细胞的比例。为了进一步探究精神压力对T细胞功能的影响,我们对小鼠脾脏T细胞进行RNA-seq测序,发现AR模型小鼠脾脏T细胞中G protein-coupled receptor 54(Gpr54)表达显著升高,而T细胞激活相关基因表达却明显降低。此外AR模型小鼠血清中神经肽激素kisspeptin的水平明显增加,同时其受体Gpr54在下丘脑、脾脏中的表达也显著上调,说明kisspeptin/GPR54信号在AR诱导的神经、内分泌及免疫稳态失衡中可能发挥重要作用。为了进一步探究神经内分泌系统对肿瘤免疫微环境的调控作用,我们对AR模型小鼠进行皮下荷瘤,发现AR处理不仅明显促进肿瘤的生长,还显著增加血清kisspeptin水平及肿瘤浸润T细胞中Gpr54的表达,同时降低肿瘤免疫微环境中CD4+和CD8+T细胞的比例,并增加CD8+T细胞的耗竭,说明kisspeptin/GPR54信号在神经内分泌免疫调控的肿瘤进展中具有重要作用。为了明确kisspeptin/GPR54对肿瘤发生、发展的调控作用,我们首先对临床样本中GPR54的表达与肿瘤预后进行生物信息学分析,发现GPR54的表达与肺腺癌和肺鳞癌组织中CD8+T细胞的浸润呈明显负相关,且GPR54的高表达与肺腺癌患者的不良预后相关。同时,kisspeptin-10(KP-10)的体外处理可以明显抑制CD8+T细胞的功能,促进CD8+T细胞耗竭,说明kisspeptin/GPR54信号可能是免疫逃逸的重要指标。随后,我们构建了T细胞特异性缺失Gpr54的小鼠进行功能验证。发现无论是在慢性精神压力还是正常小鼠中,T细胞特异性缺失Gpr54均可通过抑制T细胞功能失调和耗竭来抑制肺癌的进展。为了进一步明确Gpr54对CD8+T细胞抗原特异性免疫功能的作用,我们构建了Gpr54缺失的OT-1小鼠模型。我们发现AR处理可以减弱OT-1小鼠中CD8+T细胞对OVA阳性肿瘤细胞的特异性杀伤活性,而Gpr54缺失的CD8+T细胞在低效靶比时对肿瘤细胞具有更好的肿瘤杀伤效果,说明GPR54对于CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫功能具有重要的抑制作用。在机制上,T细胞特异性缺失Gpr54不影响T细胞激活相关信号通路lymphocyte protein tyrosine kinase(LCK)、Rous sarcoma oncogene(Src)和zeta-chain(TCR)associated protein kinase(Zap70)的磷酸化,但可以显著降低T细胞耗竭相关基因nuclear receptor subfamily 4 group A member 1(NR4A1)的表达。Kisspeptin可以促进离子霉素诱导的mitogen-activated protein kinase 7(ERK5)磷酸化,而这种激活在2-APB螯合胞内Ca2+后受到抑制。此外,T细胞特异性缺失Gpr54可显著降低离子霉素诱导的ERK5磷酸化。与此同时,ERK5特异性抑制剂XMD8-92可以显著降低CD8+T细胞的耗竭,增强CD8+T细胞抗肿瘤功能从而抑制肿瘤生长。这些结果表明ERK5/NR4A1激活对kisspeptin/GPR54介导的T细胞功能障碍至关重要。为进一步探究靶向GPR54信号在肿瘤免疫治疗中的潜在价值。我们采用Gpr54缺失和野生型的OT-1 T细胞开展过继性肿瘤免疫细胞治疗研究,发现Gpr54缺失的OT-1 CD8+T细胞具有更强的肿瘤杀伤效果以及更低的抑制性受体表达。为进一步探究GPR54及ERK5敲除在临床中的应用前景,我们利用健康供者的T细胞分别构建了靶向CD19和Prostate Specific Membrane Antigen(PSMA)的CAR-T细胞,并利用Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9(CRISPR/Cas9)技术分别对GPR54和ERK5基因进行敲除,结果表明GPR54缺失可以显著促进PSMA-CAR-T细胞的增殖和细胞因子释放,提高PSMA-CAR-T细胞的肿瘤细胞杀伤活性,同时降低PSMA-CAR-T细胞的耗竭表型。而ERK5缺失的PSMA-CAR-T和CD19-CAR-T细胞也可以显著增加CAR-T细胞的细胞毒性作用,促进细胞因子释放,同时降低CAR-T细胞的耗竭。以上结果表明,GPR54或ERK5缺失可以增强TCR-T或CAR-T细胞治疗中T细胞的肿瘤杀伤功能,具有一定的临床应用前景。综上所述,本课题发现了kisspeptin/GPR54信号在神经、内分泌以及免疫系统交互调控肿瘤发生、发展中的关键作用。GPR54及下游ERK5信号缺失,可以抑制慢性压力诱导的肿瘤生长,减弱T细胞耗竭,增强T细胞介导的抗肿瘤免疫治疗效果。本研究为深入理解神经、内分泌、免疫稳态调控以及肿瘤免疫逃逸的分子机制提供了重要的理论依据,也为基于T细胞的肿瘤免疫细胞治疗效果的优化提供了新的靶点和思路。