鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）是一种缺乏细胞壁的原核生物,其作为病原所引发的慢性呼吸道疾病是家禽养殖场最常见的疾病之一,MG感染导致雏鸡生长发育迟缓,蛋鸡产蛋量减少,肉鸡体重下降,给世界各地养禽业造成巨大的经济损失。目前对于MG的防治策略主要停留在抗菌药物的使用上,但抗菌药物的滥用也带来了细菌耐药性增加以及药物残留等负面问题,因此,寻找理想替代抗菌药物的MG防治策略仍是兽医临床重点研究方向。呼吸道菌群作为呼吸道健康的“守护者”对于增强宿主呼吸道抵抗力极为关键。越来越多的研究表明呼吸道菌群紊乱与呼吸道免疫力低下及呼吸道疾病有着十分密切的联系。呼吸道黏膜免疫系统是呼吸道抵抗外来病原体侵袭的“第一道”防线,在识别和清除病原体的过程中发挥至关重要的作用。Th1/Th2免疫平衡机制是机体在疾病发展过程中的重要免疫学基础。本课题拟将呼吸道菌群相关的微生物调控或免疫调节疗法引入到MG引起的慢性呼吸道病防治中,研究MG感染与呼吸道菌群的相关性及唾液乳杆菌通过重塑呼吸道菌群结构缓解MG所致气管炎症损伤机制,旨在为MG的防治及微生物新型治疗方案提供依据。（1）MG感染与呼吸道菌群相关性及机制研究首先构建了不同感染时长的鸡MG感染模型,结果表明MG可引起感染鸡气管炎症损伤,破坏Th1/Th2免疫平衡,显著降低气管抗氧化酶活性及外周血CD4+T/CD8+T淋巴细胞比值（p＜0.01）,并通过16S r RNA高通量测序证实MG感染导致呼吸道菌群紊乱。此外,MG感染可对肺脏造成病理损伤及氧化应激,并在感染后第3 d和第5 d时,诱导肺部T淋巴细胞向Th1细胞分化,在感染后第7 d时,诱导肺部T淋巴细胞向Th2细胞分化。MG感染还可导致HD11细胞的超微结构发生异常变化,在感染6 h时,通过TLR4分子激活JAK/STAT信号通路诱导细胞发生促炎反应;在感染10 h时通过抑制JAK/STAT信号通路活化诱导抗炎反应。呼吸道菌群移植试验结果证实呼吸道菌群紊乱可参与MG感染诱导气管炎症损伤,接受MG感染鸡呼吸道菌群移植1 d后,气管表现出严重的病理损伤及氧化应激,Th1型细胞因子表达水平显著降低（p＜0.05）,SIg A与Th2型细胞因子表达水平均显著升高（p＜0.01）,并抑制JAK/STAT信号通路的活化;接受MG感染鸡呼吸道菌群移植7 d后,Th1型细胞因子表达水平显著增加（p＜0.05）,SIg A与Th2型细胞因子表达水平显著减少（p＜0.05）,并激活JAK/STAT信号通路,这些结果表明MG感染导致的呼吸道菌群紊乱可诱导Th1/Th2免疫失衡,破坏呼吸道黏膜屏障,具体机制是MG感染导致的呼吸道菌群紊乱诱导气管紧密连接蛋白表达降低以及通过降低CD4+T/CD8+T淋巴细胞比值诱导了宿主免疫抑制。以上结果证明了呼吸道菌群在MG感染诱导气管炎症损伤中的作用,为MG感染的防治拓宽了新的思路。（2）呼吸道菌群紊乱对MG感染的影响及机制研究首先通过鼻内滴注抗生素“鸡尾酒”（含1 g/L氨苄西林、0.5 g/L盐酸万古霉素、1 g/L硫酸新霉素和1 g/L甲硝唑）以选择性消除鸡呼吸道菌群,结果表明,与正常呼吸道菌群组相比,联合使用上述四种抗生素及使用硫酸新霉素、甲硝唑消除呼吸道菌群后气管MG定植明显增加（p＜0.01）,气管炎症损伤加剧,呼吸道黏膜屏障完整性受损严重,这些结果说明完整的呼吸道菌群有助于抵抗MG感染。此外,在呼吸道菌群紊乱的基础上通过鼻内滴注鸡源IL-4及IL-12重组蛋白,证实了呼吸道菌群紊乱诱导呼吸道黏膜Th1/Th2免疫失衡,进而促进了MG在气管的定植,而IL-4重组蛋白可以恢复气管抗MG能力,提示呼吸道菌群有可能通过调节Th1/Th2免疫平衡发挥抗MG作用。为了筛选出是哪一种呼吸道细菌影响了MG感染,对呼吸道灌洗液中细菌进行分离培养并验证,结果表明MG感染后对硫酸新霉素和甲硝唑敏感的狄氏副拟杆菌丰度显著下降。本试验发现鼻内补充狄氏副拟杆菌可显著减少气管MG定植量（p＜0.01）,并通过上调紧密连接蛋白表达含量改善呼吸道黏膜屏障完整性,从而缓解MG所致气管炎症损伤。以上结果表明呼吸道菌群紊乱增加了MG在气管内的定植,并通过破坏呼吸道黏膜屏障完整性促进MG感染所致气管炎症损伤。（3）唾液乳杆菌通过重塑呼吸道菌群结构缓解MG所致气管炎症损伤的作用研究本课题组前期研究初步证实肠道来源的唾液乳杆菌作为饲料添加剂可显著减轻MG感染所致肺组织炎症损伤。然而,唾液乳杆菌对MG感染的关键作用机制尚不清楚。本研究首先通过构建MG感染模型并在鼻内滴注唾液乳杆菌进行干预,发现唾液乳杆菌可显著降低气管MG定植量（p＜0.01）,缓解MG所致气管病理损伤及改善MG感染诱导免疫功能抑制。进一步研究发现唾液乳杆菌可通过调节呼吸道黏膜Th1/Th2免疫平衡、抑制JAK/STAT信号通路的活化、增强黏膜屏障功能发挥抗MG感染的作用。此外,本研究发现唾液乳杆菌明显改善MG感染导致的呼吸道菌群紊乱,并且MG感染后呼吸道菌群相关的代谢产物如吡哆醇、吲哚、泛酸含量显著升高（p＜0.05）,L-艾杜糖醇、L-异亮氨酸和二甲基砜含量显著降低（p＜0.05）,而唾液乳杆菌可以明显恢复二甲基砜、吡哆醇及L-异亮氨酸含量趋于正常水平（p＜0.05）。以上结果表明呼吸道菌群及其相关代谢物在MG感染中的作用,证实了唾液乳杆菌可以通过重塑呼吸道菌群及其相关代谢物稳态,有效抑制MG诱导的气管炎症损伤。（4）二甲基砜减轻MG所致炎症损伤及其抗炎机制研究本试验前期结果已经证实了在MG感染时二甲基砜含量显著减少,而唾液乳杆菌可恢复二甲基砜含量的异常变化。然而,二甲基砜对MG感染的影响尚不明确。本研究首先通过构建MG感染鸡模型并在鼻内滴注二甲基砜进行干预,证实二甲基砜可显著缓解MG所致气管病理损伤,减轻MG所致气管氧化应激并抑制炎性细胞因子的产生。其次构建MG感染HD11细胞模型并给予二甲基砜干预,发现二甲基砜可明显改善MG所致HD11细胞超微结构的异常变化,抑制MG感染引起的细胞死亡并减轻MG所致细胞炎症损伤。具体作用机制是二甲基砜通过下调NF-κB信号通路相关蛋白（TLR4,p-IκBα/IκBα,p-p65/p65,IL-1β,TNF-α）和MAPK信号通路相关蛋白（p-JNK/JNK,p-ERK/ERK）表达水平,抑制NF-κB/MAPK信号通路活化,从而减轻MG所致炎症损伤。以上结果揭示了二甲基砜在防御MG感染中的关键作用,并验证其具有较好的抗炎作用。综上所述,MG感染所致呼吸道和HD11细胞炎症损伤及其Th1/Th2免疫失衡均与呼吸道菌群密切相关,唾液乳杆菌、二甲基砜可通过调节呼吸道黏膜Th1/Th2免疫平衡,抑制JAK/STAT、NF-κB/MAPK信号通路活化,增强黏膜屏障功能而发挥抗MG感染作用,本研究可为MG感染的防治提供新策略。