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背景:最新的流行病学研究结果显示,心功能不全是老年人心血管疾病患病和死亡的主要原因之一[1,2]。心脏功能障碍的发病机制是多因素的,通常与心肌细胞肥厚导致的心脏重塑有关[3,4]。根据心脏负荷增加的类型、持续时间和幅度可分为两种类型:心肌肥厚被分类为生理性心肌肥厚或病理性心肌肥厚[5,6]。个体发育过程中的心脏生长是由增生和肥厚共同实现的,这不被认为是心肌肥厚。当心肌肥厚与正常或增强的心脏功能相关时,心肌肥厚被归类为生理性肥厚,通常发生在身体发育、怀孕或运动时[7,8]。当心肌肥厚与心脏功能障碍相关时,心肌肥厚被归类为病理性肥厚。病理性心肌肥厚通常发生在存在心血管疾病（CVD）的情况下,它最终会导致心力衰竭等不良预后[9]。这种形式的心肌肥厚与循环激素增加、血流动力学超负荷、心肌细胞丢失以及收缩和舒张功能降低有关[10,11]。因此,更为深入的探究病理性心肌肥厚过程中的潜在分子机制,对于发现并开发新型治疗策略以抑制心肌肥厚进而缓解心力衰竭进展等不良预后具有重要意义。O-连接的β-N-乙酰氨基葡萄糖（O-linkedβ-N-acetylglucosamine,O-GlcNAc,以下简称O-糖基化）对丝氨酸/苏氨酸蛋白残基的翻译后修饰是一个动态的、普遍存在的PTM,会影响蛋白功能及其转录[12]。已发现多达4000多种且可能更多的蛋白质存在O-糖基化修饰,O-糖基化蛋白修饰是通过一种O-糖基化转移酶（O-GlcNAc transferase,OGT）和一种O-糖基化清除酶（O-GlcNAcase,OGA）催化下发生的[13,14]。因此,与许多其他PTM相比,O-糖基化水平被认为以更协调的方式变化。蛋白O-糖基化水平也由糖酵解的分支途径的通量决定,该分支途径称为己糖胺生物合成途径（hexosamine biosynthesis pathway,HBP）,该途径整合了氨基酸、碳水化合物、脂肪酸、核苷酸和能量代谢[15]。代谢成果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate,F6P）的葡萄糖可以进入HBP或通过糖酵解继续产生丙酮酸[16]。L-谷氨酰胺:果糖-6-磷酸酰胺转移酶（L-glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase,GFAT）是限速HBP酶,使用谷氨酰胺催化F6P转化为葡糖胺-6-磷酸[17]。研究发现总蛋白O-糖基化水平在人类和动物模型中包括肥厚和心力衰竭在内的心脏疾病期间升高[18,19]。然而,关于蛋白质O-糖基化在心肌肥厚中被调控的机制仍有待进一步探索。泛素化是细胞内蛋白质一种重要的翻译后修饰,其参与调节多种生物学功能[20],在肿瘤发生发展中发挥重要作用[21,22]。蛋白质泛素化过程是可逆的,它可以被去泛素化酶（deubiquitinating enzymes,DUBs）特异性将与底物蛋白结合的泛素分子解离出来而逆转[23,24]。泛素特异性肽酶47（Ubiquitin-specific peptidase 47,USP47）是一种由1375个氨基酸构成的半胱氨酸蛋白酶,包含USP的特征性His和Cys催化结构域和四个泛素样结构域[25]。USP47是DUBs的USP亚家族成员,与其他USPs相似,USP47通过从不同底物中去除泛素缀合物来调控其稳定性、定位或活性,进而参与调节DNA损伤修复[26]、炎性体激活[27]、上皮间质转化[28],并影响肿瘤细胞的增殖和凋亡。研究发现在心肌细胞中缺血/再灌注损伤模型中,USP47表达以时间依赖性方式增加,机制研究发现USP47通过NF-κB激活调控大鼠心肌细胞凋亡[29]。然而,其在心肌肥厚过程中的作用及具体分子生物学机制仍有待阐明。mTOR（The mechanistic target of rapamycin）是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸激酶,属于磷酸肌醇激酶相关激酶（PIKK）家族[30]。它是一种进化上保守的蛋白质,在调节细胞生理、代谢和应激反应中起着核心作用。m TOR与特异性衔接蛋白相互作用,形成两种不同的大分子复合物,命名为m TOR复合物1（m TORC1）和m TOR复合物2（m TORC2）[31]。二者都包含两个核心组分:m TOR和m LST8,区别在于第三个核心组分:于m TORC1为Raptor蛋白,而于m TORC2为Rictor蛋白。最新的研究发现m TORC2活性也可通过摄取葡萄糖或谷氨酰胺等营养物质而增强,通过影响GFAT1 Ser-243位点磷酸化来控制HBP效应[32]。有趣的是,如上所述GFAT1通过异构化糖酵解代谢物F6P来催化HBP的初始步骤,并经一系列后续反应后最终影响UDP-GlcNAc的产生,而UDP-GlcNAc是蛋白质O-糖基化的关键前体。因此,在心肌细胞中m TORC2/GFAT1轴对于蛋白质的O-糖基化过程中可能发挥着关键作用。目的:在本研究中,我们发现TAC术构建压力性负荷诱导的小鼠心肌肥厚模型和血管紧张素（Angiotensin II,Ang II）诱导体外心肌肥厚模型中USP47的表达均明显增加;下调原代心肌细胞中USP47的表达后可显著增加Ang II诱导的心肌细胞肥厚,而上调原代心肌细胞中USP47的表达后可显著抑制Ang II诱导的心肌细胞肥厚。此外,我们通过实验证明USP47调节心肌肥厚的作用是通过调控心肌细胞中蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰介导的。进一步机制研究发现,USP47通过去泛素化修饰m TORC2的关键蛋白Rictor并稳定其表达,进而抑制GFAT1磷酸化介导的O-GlcNAc糖基化修饰,从而调控心肌肥厚进程。方法:1、我们首先利用TAC术构建压力性负荷诱导的小鼠体内心肌肥厚模型和血管紧张素（Angiotensin II,Ang II）诱导体外心肌肥厚模型。小鼠心脏大体图证明模型构建成功,再利用qRT-PCR及WB检测USP47在对照组以及模型组中的表达差异。进一步提取原代心肌细胞以及原代成纤维细胞明确在哪种细胞中USP47表达出现变化。2、在上一步明确了心肌细胞中USP47发生变化后,提取原代心肌细胞进行后续实验。在原代心肌细胞中改变USP47表达,使用qRT-PCR及WB验证USP47的干扰或者过表达成功。再进一步研究USP47对Ang II诱导心肌细胞肥厚的影响;3、利用Western blot检测改变USP47后,心肌细胞的糖基化水平。通过qRT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光实验检测USP47是否通过调控心肌细胞O-GlcNAc糖基化修饰水平参与Ang II诱导的心肌细胞肥厚。并使用O糖基化诱导剂及GFAT1抑制剂明确USP47通过影响GFAT1磷酸化进而影响心肌细胞糖基化水平;4、利用蛋白质质谱、免疫共沉淀、CHX蛋白质降解速率和体内泛素化水平实验检测USP47对Rictor的去泛素化作用,阐明USP47通过稳定Rictor进而调节O-GlcNAc糖基化修饰促进心肌细胞肥厚。结果:1、小鼠心脏大体图显示TAC术构建心肌肥厚模型成功,进一步对心脏进行分析,USP47在心肌肥厚模型中表达升高。提取原代心肌细胞及原代成纤维细胞检测后确定USP47在心肌肥厚模型的原代心肌细胞中表达增加。2、qRT-PCR及WB证明USP47的干扰或者过表达成功。在PBS刺激下的心肌细胞改变USP47,心肌细胞面积未出现改变。在Ang II诱导的原代心肌细胞中过表达USP47后发现,心肌细胞面积较正常对照组明显减少,而降低USP47表达后,心肌细胞面积明显增加。3、在PBS刺激下的心肌细胞改变USP47后,细胞糖基化水平未出现变化。在Ang II刺激下的心肌细胞过表达USP47后,细胞糖基化水平下降,并且GFAT1磷酸化水平增加。在Ang II刺激下的心肌细胞敲低USP47后,细胞糖基化水平升高,且GFAT1磷酸化水平下降。进一步利用糖基化诱导剂及GFAT1抑制剂设计回复实验证明USP47通过促进GFAT1磷酸化抑制细胞糖基化。4、USP47与Rictor结合,并通过Rictor促进GFAT1磷酸化。泛素化实验及降解速率实验得出结论,USP47通过降低Rictor泛素化水平进而稳定Rictor蛋白表达。USP47通过稳定Rictor调控O-GlcNAc糖基化修饰参与心肌肥厚过程。结论:1、USP47在病理性心肌肥厚过程中的表达增加;2、USP47抑制Ang II刺激下的心肌细胞肥厚;3、USP47通过促进GFAT1磷酸化抑制Ang II刺激下的心肌细胞糖基化;4、USP47稳定Rictor调控O-GlcNAc糖基化修饰参与心肌肥厚过程;