第一部分:引言口腔鳞状细胞癌（OSCC）是世界上常见的恶性肿瘤之一;目前,其治疗方法主要为外科治疗和化疗,但确诊后五年生存率偏低。因此,寻找新的诊断及预后标志物和探寻OSCC发生、发展的分子机制,能提高OSCC早期诊断率和生存率。前期文献报道OSCC患者颈部淋巴结转移和侵袭与多条分子信号通路相关,这些信号通路是影响OSCC患者预后的关键因素。本研究拟应用WGCNA等生物信息学技术筛选OSCC临床性状相关的关键通路和枢纽基因,深入挖掘关键通路基因对OSCC生存率、病理分期、迁移和侵袭等的影响。进一步对迁移侵袭相关的β-catenin蛋白在OSCC患者中表达和临床性状关系进行分析。应用整合组学筛选β-catenin通路相关,发现与OSCC生存、迁移侵袭相关的新关联蛋白RUVBL1。我们还在分子、细胞和临床标本水平研究RUVBL1与OSCC生存和病理分期的相关性,证明RUVBL1能否成为OSCC治疗、预后新的靶点。最后,基于免疫组化分析β-catenin通路相关蛋白在OSCC中的表达,构建多因素的Cox回归模型和列线图用于预测OSCC患者生存预后。上述研究初步揭示RUVBL1参与β-catenin通路的分子机制,可能为OSCC患者提供更加有效的治疗方案,从而提高生存率。第二部分:加权基因共表达网络挖掘口腔鳞状细胞癌关键基因模块、信号通路和枢纽基因目的:应用加权基因共表达网络（WGCNA）挖掘口腔鳞状细胞癌关键基因模块、信号通路和枢纽基因方法:1.从公共数据库中下载TCGA-HNSC表达矩阵和相关信息重建TCGA-OSCC数据集;2.应用WGCNA筛选与临床性状高度关联的关键模块基因;3.构建模块基因相互作用网络及对网络内基因进行信号通路注释;4.根据构建的基因相互作用网络结合基因表达情况筛选与OSCC生存相关基因。结果:1.基于重新构建的TCGA-OSCC数据集和对应的临床信息,应用WGCNA分析筛选获得MEgreen和MEyellowgreen两个与生存率和grade相关的模块;2.KEGG和Reactome通路分析显示这两个模块基因于多条肿瘤通路密切相关,包括MAPK,CTNNB1,PI3K-AKT等;3.根据基因表达和生存率分析,筛选发现MAPK3和CTNNB1两个关键的基因。结论:WGCNA能用于挖掘OSCC关键癌基因,其中MAPK3和CTNNB1将作为重点进行研究。第三部分:口腔鳞状细胞癌中β-catenin表达与临床特征的相关性分析目的:确定β-catenin在OSCC中的表达和定位,探讨β-catenin表达与预后等临床特征的相关性方法:1.通过分析公共数据库GEO和HPA中β-catenin表达情况,确定β-catenin在不同人群和地区的OSCC患者中表达情况以及与生存率的相关性;2.免疫组织化学检测40例OSCC患者中β-catenin的表达;3.分析β-catenin的表达量及细胞核易位与OSCC患者预后的相关性。结果:1.公共数据分析结果表明,β-catenin在不同人群和地区的OSCC患者中存在差异;2.卡方检验结果表明β-catenin表达与OSCC肿瘤组织学分级、TNM分期、生存率以及淋巴结转移密切相关（P＜0.05）;3.HPA数据库也发现β-catenin表达与总生存相关（Log-rank p=0.0135）,且高表达的β-catenin与预后不良相关;4.通过分析采集的40例样本的生存数据和相应的β-catenin免疫组织化学结果,Kaplan–Meier曲线表明高表达β-catenin与预后不良相关（Log-rank p=0.0254）,且β-catenin细胞核易位患者表现出不良预后（Log-rank p=0.0002）。结论:β-catenin表达和核易位可能成为测OSCC预后的生物标志物。第四部分:口腔鳞状细胞癌中β-catenin通路关键生存相关基因的筛选和鉴定目的:筛选和鉴定口腔鳞状细胞癌中β-catenin通路新的关键生存基因。方法:1.利用GEO数据集,GEPIA数据库,Networkanalyst在线网络,IMEx和STRING数据库以及Cytoscape进行可视化分析进β-catenin-蛋白相互作用网络构建和关键基因筛选;2.使用Metascape与KEGG,Reactome通路数据库对β-catenin相关基因进行通路注释和分析;3.应用GPEIA数据库分析β-catenin与相关基因表达的Pearson相关系数;4.应用GPEIA数据库分析β-catenin关键基因的总体生存率热图和Kaplan-Meier生存曲线。5.使用免疫组化法检测组织芯片中RUVBL1蛋白表达水平,并应用卡方检验分析表达与临床特征相关性。结果:1.从β-catenin相互作用蛋白网络构建筛选出14个关键基因（连接度＞10）;2.KEGG,GO和Reactome功能注释,信号通路富集分析表明这些β-catenin通路的关键基因均富集在与癌症相关的通路;3.Pearson相关系数分析显示12个基因的表达与β-catenin表达呈正相关;4.总生存热图结果和Kaplan-Meier曲线显示DKK1和RUVBL1是对患者总生存率影响最显著的两个关键基因。5.组织芯片的免疫组化结果和卡方检验提示RUVBL1的表达与病理组织学分期（Grade）相关。结论:初步筛选出OSCC中β-catenin通路新的关键生存基因RUVBL1。第五部分:靶向抑制RUVBL1抑制口腔鳞状细胞癌细胞系的增殖、转移和侵袭目的:探讨靶向抑制RUVBL1对OSCC细胞系的增殖、转移和侵袭的影响。方法:1.si RNA和CB-6644靶向抑制RUVBL1后,应用CCK8的细胞毒性实验与克隆形成实验检测OSCC细胞系H157和Cal-27细胞生长增殖情况;2.si RNA和CB-6644靶向抑制RUVBL1后,进行细胞划痕实验和侵袭实验,检测靶向抑制RUVBL1后对OSCC细胞迁移、侵袭能力的影响;3.Western blotting检测β-catenin、RUVBL1及通路相关蛋白的改变。结果:1.通过si RNA和CB-6644靶向抑制RUVBL1后,CCK8检测表明OSCC细胞系H157和Cal-27增殖受到抑制;2.细胞克隆实验表明RUVBL1si RNA与CB-6644显著降低H157细胞的生长,并减小了克隆的大小;3.细胞划痕迁移实验表明RUVBL1 si RNA组能抑制约50%至30%的细胞迁移能力。同时,CB-6644以梯度依赖性抑制细胞迁移能力;4.Transwell细胞侵袭实验表明RUVBL1 si RNA和CB-6644均能降低穿过transwell膜的细胞数量;5.蛋白免疫印迹结果表明si RNA和CB-6644的靶向抑制降低RUVBL1表达,抑制β-catenin、vimentin表达,增加E-cadherin表达。结论:RUVBL1可能通过参与激活β-catenin通路发挥促进OSCC细胞增殖、转移和侵袭的作用,而靶向抑制RUVBL1能抑制这些作用。第六部分:基于RUVBL1等β-catenin通路关键基因构建口腔鳞状细胞癌患者生存预测模型目的:基于多个β-catenin通路关键基因和临床信息应用多因素Cox模型构建OSCC患者生存预测模型和列线图。方法:1.从医院收集OSCC患者组织石蜡标本,免疫组化分析β-catenin、vimentin、RUVBL1、E-cadherin、DKK1,并进行评分;2.多因素Cox回归模型、逐步回归和主成分分析（PCA）选择影响疾病无进展（PFS）生存率的关键基因和临床因素;3.应用Concordance-index、ROC曲线、Calibration曲线等方法对四因素Cox风险评分模型进行评价;4.为了直观地展示四因素Cox风险评分模型,构建可视化和交互式列线图模型来预测OSCC患者PFS生存率。结果:1.应用IHC对五个基因（Vimentin、RUVBL1、β-catenin、E-cadherin、DKK1）表达进行评分,结合年龄、stage、grade三个临床性状构建多因素的Cox生存预测模型;2.逐步回归和主成分分析发现其中四个因素（Vimentin、RUVBL1、β-catenin表达以及stage）构建的Cox回归模型即可用于预测OSCC生存率;3.Concordance-index、ROC曲线、Calibration曲线结果表明四因素Cox风险评分模型与八因素模型之间无显著差异;4.基于这四种标志物的个体表达水平和临床性状构建了风险评分公式来计算每位患者的风险得分。5.成功构建基于四因素Cox风险评分模型的可视化和交互式列线图模型来预测OSCC患者PFS生存率。结论:基于多个β-catenin通路关键基因Vimentin、RUVBL1、β-catenin表达以及临床信息stage,应用多因素Cox模型成功构建OSCC患者生存预测模型和交互式列线图。