论文部分内容阅读
EKLF/KLF1是Kruppel样转录因子家族(Kruuppel-like transcription factors,KLFs)成员之一,是一个重要的红系调控因子,参与调节红细胞一系列的生长发育过程,包括调控β-类珠蛋白表达,细胞周期,合成亚铁血红素、细胞骨架及膜蛋白等等。研究证明,EKLF参与调控胎儿血红蛋白(Fetal hemoglobin,Hb F;α2γ2)向成人血红蛋白(Adult hemoglobin A,Hb A;α2β2)的转化过程。当EKLF单倍体剂量不足,可显著性地提高HbF水平。因此,在β-地贫患者中通过下调EKLF的表达量提高HbF水平可能成为一种有效的改善临床表型的方法。本研究通过一系列的体内外功能性实验,探索EKLF启动子区甲基化水平以及靶向作用于3’UTR的microRNA(miR-326)是否与负性调控EKLF表达相关,能否作为改善β-地贫患者临床表型严重性的新靶点。其中包括通过重亚硫酸氢盐处理DNA后测序和RT-qPCR对人不同组织的EKLF基因的启动子区DNA甲基化程度及mRNA水平进行定量,随后通过5-Aza-CdR药物处理,双荧光素酶实验及胶迁移实验等一系列体外功能性实验进一步验证EKLF基因的启动子区DNA甲基化对基因表达的影响。另外,本研究通过生物信息学及双荧光素酶实验筛选出靶向作用于EKLF 3’UTR的microRNA,进一步通过剂量效应,拯救实验,过表达及敲降miR-326检测相关基因的表达来验证。同时也在β地中海贫血病人及正常人中,通过RT-qPCR和血红蛋白HPLC实验验证人体内miR-326表达量与HbF水平的相关性。实验结果表明,EKLF基因的启动子区DNA甲基化谱呈组织特异性。其中EKLF基因启动子区的DNA在红细胞中基本上完全没有被甲基化。有趣的是,EKLF基因有且仅有在红细胞中表达。EKLF基因启动子区DNA去甲基化可以使EKLF基因在非红细胞中表达。进一步地,实验发现启动子区DNA甲基化主要是通过抑制可激活EKLF基因转录的转录因子GATA1及MYB的结合,从而使基因沉默的。另一方面,通过生物信息学预测及体外功能性实验,我们筛选出一个可以靶向作用于EKLF 3’UTR的microRNA——miR-326。miR-326可通过降低EKLF蛋白水平,进一步下调BCL11A,HBB及上调HBG的表达。同时,在重型β地中海贫血病人中,我们发现病人体内的miR-326的表达量与HbF水平呈正相关。本研究通过启动子区DNA甲基化以及microRNA这两种表观负性调控作用扩展了影响EKLF基因表达的分子机制。其中,EKLF基因启动子区DNA甲基化参与维持组织特异性表达。miR-326参与β地中海贫血条件性压力造血的调控,同时也为microRNA表达异常可影响β-地中海贫血病人中胎儿血红蛋白向成人血红蛋白转换提供了新视角。下调EKLF的表达量来提高HbF水平的方式可能会成为一种治疗β-地中海贫血及镰刀型贫血新手段。