研究背景流行病学资料显示:在恶性肿瘤中,结/直肠癌的发病率及病死率均位居前列。过去十年里,尽管各国研究者在结/直肠癌的治疗药物及治疗策略研发领域中投注大量精力,取得不少进展。但是,结/直肠癌的病死率仍然居高不下。因此,寻找结/直肠癌预防靶点以及预防药物,降低其发病率,十分必要。饮食在结/直肠癌发生、发展中扮演的角色正日益受到关注。世界卫生组织已将不健康饮食列为结/直肠癌发生、发展的危险因素之一,并指出以水果、蔬菜为主的饮食可显著降低结/直肠癌发病风险。研究表明:苹果,具有其他水果不能比拟的肠道保健功能,其日摄入量与结直/肠癌的发病风险呈负相关。苹果的抗氧化能力在所有水果中位居第二,所含黄酮,多酚具有良好的抗肿瘤活性。然而,这些抗氧化物质主要存在于苹果皮中,含量不多。苹果的果肉富含多糖,文献报道:混浊的苹果汁可有效抑制实验性结肠癌的发生,而透明的苹果汁却无此功效。使得苹果汁混浊的主要成分之一就是多糖。若从苹果中提取多糖,并验证其具有抗结肠肿瘤活性,无疑会给苹果在结/直肠癌预防中的应用、普通人群以及结肠癌高危人群(如:炎症性肠病患者)的结/直肠癌预防带来积极影响。植物多糖的作用机制复杂。目前,人们尝试应用高通量筛选手段,例如:基因芯片、蛋白芯片等技术研究其可能的作用靶点,并获得一定结果。另外,由于植物多糖一般含有半乳糖、半乳糖醛酸组分,对半乳糖残基具有特异识别功能的半乳糖凝集素家族便成为其可能的结合及调节靶点。其中,半乳糖凝集素-3(galectin-3,gal-3)的研究较为透彻,与结/直肠癌的发生发展密切相关。Gal-3参与正常细胞的生长、分化、凋亡,肿瘤细胞的发生、发展、粘附、侵袭与转移等过程的调节。Gal-3不仅参与调控了炎症的转归,被认为是一种促炎因子,而且具有肿瘤预警作用,它的表达变化与结/直肠肿瘤的发生、发展和/或转移相关:同正常结肠组织细胞相比,结肠癌组织细胞的细胞质中gal-3表达明显升高,细胞核内的表达显著降低。结肠癌发生转移的患者,血清中gal-3的浓度明显高于原位结肠癌患者血清中的浓度,而后者的浓度又显著高于正常人血清中的浓度。若证明苹果多糖能够影响gal-3的表达,干预gal-3的功能,将为阐明苹果多糖的作用机制以及证明其成药可能奠定基础。实验方法本研究以结肠癌细胞系SW-1116,HT-29,SW-620以及结肠炎相关的小鼠结肠癌模型为基础,进行低分子量苹果多糖(分子量:1000-3000)的抗肿瘤活性评价与机制研究。实验分为三部分:第一部分:结肠炎相关的结肠癌模型建立与低分子量苹果多糖的结肠癌预防作用评价。将雄性五周龄ICR小鼠120只,随机分为5组:模型组、3个给药组和对照组(除模型组为40只,其余各组均为20只)。模型组与给药组小鼠腹腔注射15mg/kg的1,2-二甲肼(DMH)。一周后,饮用2%右旋葡聚糖苷钠(DSS)蒸馏水溶液一周,间隔两周后,再次饮2%用DSS蒸馏水溶液一周。对照组小鼠于实验开始时腹腔注射生理盐水,随后不再给予处理。第九周时,在给药组的小鼠饲料中加入低分子量苹果多糖,使其含量分别为2.5%,5%与10%。二十周时乙醚麻醉,处死所有小鼠,收集小鼠肠道样本,用于病理学检测及Westernblot实验。第二部分:以免疫荧光及免疫组化的方法观察癌变小鼠肠道以及结肠癌病人肠道粘膜半乳糖凝集素-3(gal-3)与toll样受体-4(TLR-4)的表达情况。筛选出适度表达gal-3与TLR-4的人结肠癌细胞株SW-620细胞,借助激光共聚焦,免疫沉淀以及RNA干扰等手段检测低分子量苹果多糖的可能作用靶点:gal-3与TLR-4之间的关系。第三部分:以加入0.1mg/mL低分子量苹果多糖的DMEM完全培养液培养人结肠癌细胞株HT-29两天,收集细胞总RNA进行基因芯片检测,寻找两倍变化的差异基因,并采用Westenblot手段验证其翻译后蛋白水平的变化。实验结果1、低分子量苹果多糖能有效地预防小鼠结肠炎癌变。二十周时,肉眼观察:DMH/DSS处理(模型组)小鼠,肠道可见多个息肉或毛虫状新生物。低分子量苹果多糖治疗组(给药组),除三只小鼠肠道有少量赘生物外其,余肠道均表现为不同程度的红肿样炎症状态。H.E.染色显示:模型组中,90%的小鼠肠道发生结肠腺癌和/或结肠腺瘤。饲料中加入2.5%,5%及10%低分子量苹果多糖的给药组,小鼠结/直肠肿瘤发生率率依次下降为:25%,15%与5%,且多数肠道病理表现为淋巴细胞浸润,粘膜层、粘膜下层增生等急性、慢性炎症特征性改变。2、小鼠肠道组织免疫荧光以及人类结肠癌组织芯片表明:gal-3与TLR-4表达于正常以及不同分期的结肠癌组织细胞膜上;激光共聚焦结果显示:gal-3与TLR-4共表达在SW-620的细胞膜上;免疫共沉淀结果提示:gal-3与TLR-4存在着分子伴侣的关系;使用RNA干扰手段观察到:人为下调gal-3的表达后,TLR-4的表达水平下降;而人为下调TLR-4的表达,gal-3的水平无明显变化。这提示:gal-3有可能辅助TLR-4的模式识别过程,低分子量苹果多糖可能通过影响gal-3进而影响TLR-4的表达及功能。3、安捷伦公司的人类全基因组芯片(含44,000个基因探针)检测结果显示:低分子量苹果多糖孵育2天后,结肠癌细胞株HT-29中333个基因发生显著变化。其中,30个基因上调,303个基因下调。通路分析发现:低分子量苹果多糖主要影响了结肠癌细胞的周期调节通路。细胞流式分析提示:低分子量苹果多糖可剂量依赖性的使HT-29细胞停滞于G0/G1期;细胞与小鼠肠道粘膜的Westernblot检测证明:该作用为p53非依赖性。结论1、低分子量苹果多糖可有效预防ICR小鼠实验性结肠炎癌变,有效率达95%;动物用药3个月,未见明显毒性反应。2、Gal-3与TLR-4可能存在分子伴侣关系,参与实验性结肠炎发生与癌变;低分子量苹果多糖通过影响两者的表达而发挥结肠炎癌变预防作用。3、低分子量苹果多糖可诱导HT-29细胞的G0/G1期停滞,该效应为p53非依赖性。