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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界性的常见肿瘤，在我国占据恶性肿瘤死亡率的第二位。外科手术切除是目前最有效的肝癌治疗手段，但是超过70％的患者在初次就诊时因肿瘤进展或肝功能不全而无法接受手术治疗。切除术后两年内30-50％肿瘤复发，五年复发率可高达80％，复发性肝癌能获得再切除者仅10-20％。由于外科治疗的应用受到严重限制，事实上绝大多数的病人需要接受非手术治疗。
抗肿瘤免疫是有发展前途的治疗方法之一，抗肿瘤免疫需要肿瘤抗原、抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APCs)和效应细胞的参与，局部高浓度的细胞因子能够显著放大已产生的抗肿瘤免疫。近年来有学者将大剂量的生物活性细胞因子(IL-2，IL-12等)注入小鼠活体瘤内，结果产生了保护性免疫，显著抑制了肿瘤生长。我们已经成功地建立含有小剂量白介素-2(interleukin-2，IL-2)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)的缓释微粒，并和切除的HCC组织一起配制了一种自体瘤苗以预防术后复发并取得了显著效果。在此基础上本研究建立小鼠皮下移植性肝癌模型，对模型施行瘤组织内注射细胞因子缓释微粒(cytokines microparticles，CytoMPS)制作成原位瘤苗(in situ vaccine，ISV)，观测CytoMPS-ISV治疗肝癌的抗瘤作用，并通过实验室检测探讨CytoMPS-ISV可能的抗肿瘤免疫效应。
第一部分： CytoMPS原位疫苗的抗肿瘤作用的实验
材料和方法：
1.小鼠皮下移植性肝癌模型的建立：常规体外培养小鼠Hepa 1-6肝癌细胞，于C57BL/6J小鼠皮下接种1×107个Hepa 1-6细胞建立小鼠皮下移植性肝癌模型。七天后可扪及皮下结节。用游标卡尺测量其长径(L)、短径(W)，L>5 mm者被认为接种成功，按V=(L×W×W)/2计算肿瘤体积。
2.配制含有mIL-2和mGM-CSF的CytoMPS。
3.运用已建立C57BL/6J小鼠Hepal-6细胞皮下移植肝癌模型，肿瘤长至直径5-7 mm时，瘤内注射免疫缓释微球，对照组注射PBS，观察肿瘤生长情况及小鼠生存率，分别绘制肿瘤生长曲线和统计生存率。
结果：
与PBS注射组和对照组相比，瘤内注射CytoMPS后肿瘤生长受到显著抑制(P<0.01，P<0.01)，但3组的小鼠生存率无显著差异(P>0.05)。
结论：
细胞因子免疫缓释微球瘤内注射可以显著抑制肿瘤生长，但不能改善小鼠生存率。
第二部分： CytoMPS-ISV联合手术切除的抗瘤作用
材料和方法：
1.按第一部分方法建立小鼠皮下移植性肝癌模型、制备细胞因子缓释微球，并按同样方法进行瘤内注射CytoMPS，制备CytoMPS-ISV。
2.CytoMPS-ISV联合手术切除的抗瘤作用：CytoMPS组、PBS组和空白对照组第三次瘤内注射后3天手术去除肿瘤灶，对侧胁腰部皮下再接种1.0×107 Hepa1-6细胞，观察三组小鼠的肿瘤生长情况及小鼠生存率。
结果：
与PBS注射组及空白对照组相比，联合治疗后，CytoMPS-ISV后联合手术组有37.5％(3/8)的小鼠获得保护，无瘤长期生存；PBS瘤内注射后联合手术组和对照组全部生成肿瘤。且CytoMPS-ISV后联合手术组有肿瘤生长的小鼠对比PBS瘤内注射后联合手术组和对照组，肿瘤生长受到显著抑制(P<0.01，P<0.01)，生存率显著提高(P<0.01，P<0.01)。
结论：
细胞因子免疫缓释微球瘤内注射可以显著抑制肿瘤生长，CytoMPS-ISV后联合手术切除原发肿瘤，CytoMPS-ISV后联合手术组产生保护性免疫，可以显著抑制再接种肿瘤的生长，可以显著增加小鼠的生存率。
第三部分： CytoMPS-ISV抗肿瘤免疫效应的检测
材料和方法：
1.流式细胞仪检测外周血淋巴细胞变化：CytoMPS第三次注射后3天后处死小鼠，无菌下摘除眼球，经眼动脉取血，肝素抗凝处理，1小时内送流式细胞仪检测，计算外周血CD4+T细胞、CD8+T和NK细胞变化。
2.疫苗诱导体外CTL和NK细胞的杀瘤活性检测：CytoMPS第三次注射后3天后处死小鼠，无菌取小鼠脾脏，分离脾淋巴细胞，培养7天，LDH释放法测定CTL和NK细胞的杀瘤活性，靶细胞为Hepa 1-6细胞、B16黑色素瘤细胞和Yac-1细胞，效应细胞与靶细胞的比例为20：1。
3.采用免疫组化法检测肿瘤组织的CD4+、CD8+和NK1.1+细胞浸润情况。
4.疫苗诱导CTL的抗体阻断作用：分离的脾CTL经过单克隆抗体(CD4+、CD8+、MHC-Ⅰ，Ⅱ)预处理30分钟后进行CTL细胞毒性试验(LDH释放法)。
结果：瘤内注射CytoMPS组血液中及局部浸润的CD4+、CD8+和NK细胞明显高于PBS组和对照组(P<0.05)；淋巴细胞杀伤试验结果显示瘤内注射CytoMPS组的脾CTL和NK细胞对靶细胞的杀伤率明显高于PBS组对照组(P<0.02，P<0.05)；抗体阻断作用试验显示：接种疫苗的小鼠脾CTL的杀瘤活性可被抗—CD8+、抗-MHC-Ⅰ单克隆抗体所阻断，但不被抗-CD4+、抗-MHC-Ⅱ单克隆抗体所阻断。因此，其杀瘤特性是由MHC-Ⅰ限制的CD8+T细胞所介导。
结论：
CytoMPS-ISV能诱导机体的产生以CD8+T细胞为主的抗肿瘤免疫作用，其杀瘤机制是由MHC-Ⅰ限制的CD8+T细胞所介导。