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第一部分Notch1信号通路通过调节Fascin1的表达促进胃癌侵袭与转移的机制研究(一)Notch1基因与Fascin1基因在胃癌中调控关系的研究目的:探讨胃癌细胞中,Notch1基因与Fascin1基因调控关系的研究。方法:1.用免疫组化方法检测人40例胃癌组织及癌旁正常组织中Notch1与Fascin1的表达情况,免疫印迹法(Western blot)检测4例人胃癌及癌旁组织中Notch1与Fascin1的表达情况;2.以人胃癌细胞MGC-803与SGC-7901作为实验对象,分别转染 Control-siRNA 及 Notch1-siRNA,用 Real-time PCR 和 Western blot法检测不同组Notch1与Fascin1的mRNA与蛋白表达水平;3.数据库分析Notch1与Fascin1生存期。结果:1.胃癌组织中Notch1蛋白在癌组织与癌旁组织中的阳性率分别为62.5%、20%,两者比较差异显著(P<0.05);胃癌组织中Fascin1阳性率为30%,而癌旁组织中无表达,两者比较差异显著(P<0.05);Spearman相关性分析显示,Notch1和Fascin1在胃癌中表达呈显著正相关(r = 0.394,P = 0.012)。2.在4例人胃癌及癌旁组织中,Western blot结果显示,Notch1与Fascin1在胃癌中的表达均明显高于癌旁组织。3.胃癌细胞中,MGC-803 及 SGC-7901 转染 Notch1-siRNA 后,Fascin1 mRNA和蛋白水平均明显降低(P<0.05),而Normal组(正常组)与Control-siRNA组无明显变化。4.Kmplot数据库分析得出在胃癌中Notch1高表达者总体生存期与无进展生存期均低于低表达者;在胃癌中Fascin1高表达者总体生存期与无进展生存期均低于低表达者。结论:1.Notch1与Fascin1在胃癌中具有癌基因的作用,且两者在胃癌组织中表达呈正相关;2.Notch1能够在转录和蛋白水平控制Fascin1表达;3.胃癌中Notch1或Fascin1高表达者预后较差。(二)Notch1基因通过Fascin1调控胃癌细胞侵袭和迁移的研究目的:探讨Notch1通过Fascin1调控胃癌细胞侵袭和迁移的研究。方法:1.MGC-803 与 SGC-7901 分别转染 Control-siRNA、Notch1-siRNA、Notch1-siRNA 与对照质粒(Notch1-siRNA+Control plasmid)、Notch1-siRNA 与Fascin1 质粒(Notch1-siRNA+Fascin1 plasmid),转染后培养 24 小时,用 Transwell实验检测不同处理组细胞的迁移与侵袭能力。2.MGC-803 与 SGC-7901 分别转染 Control-siRNA、Fascin1-siRNA,转染后培养24小时,用Transwell实验检测不同处理组细胞的迁移与侵袭能力。结果:1.在胃癌MGC-803及SGC-7901细胞中,与Control-siRNA组相比较,Notch1-siRNA组细胞的迁移与侵袭能力明显下降;与Notch1-siRNA组相比,Notch1-siRNA+Control plasmid共转染组细胞迁移与侵袭能力无明显变化,而Notch1-siRNA+Fascin1 plasmid共转染组细胞迁移与侵袭能力明显提高,可见Fascin1可以挽救Notch1表达下调导致的胃癌细胞迁移与侵袭能力下降趋势。2.在胃癌MGC-803及SGC-7901细胞中,与Normal组(正常组)及Control-siRNA组相比,Fascin1-siRNA组细胞迁移与侵袭能力均明显降低。结论:Notch1与Fascin1均可促进胃癌细胞的侵袭与迁移,且Notch1通过靶向Fascin1的表达来调节胃癌细胞的侵袭与迁移。(三)Notch1基因调控Fascin1基因转录机制的研究目的:在胃癌细胞中探讨Notch1调控Fascin1基因转录的可能机制。方法:数据库预测Notch1信号通路转录因子RBP-J k在Fascin1启动子上是否具有结合位点;以MGC-803作为实验对象,染色质免疫共沉淀法(ChIP实验)验证RBP-J k在Fascin1启动子上是否具有结合位点;胃癌细胞MGC-803分别在无任何处理、转染Control-siRNA和转染Notch1-siRNA条件下培养24小时,采用ChIP实验检测不同处理因素对RBP-J k与Fascin1启动子结合的影响。结果:1.我们在PROMO数据库预测到了 Notch1通路转录因子RBP-J k在Fascin1启动子上具有两个潜在结合位点。2.ChIP实验:(1)当用蛋白特异性抗体RBP-Jk沉淀与蛋白质的复合物时,在样品中能够扩增出条带,而IgG抗体则不能扩增出条带,结果表明RBP-Jk在Fascin1启动子上具有结合位点;(2)与Normal组、Control-siRNA相比,Notch1-siRNA组的条带信号明显减弱,结果说明Notch1可以调节RBP-Jk与Fascin1启动子的结合能力。结论:在胃癌细胞中,Fascin1启动子上具有RBP-Jk结合位点,Notch1通过RBP-J k调控Fascin1转录。第二部分Notch1信号通路通过调节Fascin1的表达促进结肠癌侵袭与转移的机制研究(一)Notch1基因与Fascin1基因在结肠癌中调控关系的研究目的:探讨结肠癌细胞中,Notch1基因与Fascin1基因调控关系的研究。方法:1.用免疫组化方法检测60例人结肠癌组织及癌旁组织中Notch1与Fascin1的表达情况,免疫印迹法检测6例人结肠癌及癌旁组织中Notch1与Fascin1的表达情况。2.以人结肠癌细胞HCT-116与LoVo作为实验对象,分别转染Control-siRNA及 Notch1-siRNA,用 Real-time PCR 和 Western blot 法检测不同组 Notch1 与Fascin1的mRNA与蛋白表达水平。3.人结肠癌细胞HCT-116与LoVo分别转染对照质粒(Control plasmid)及NICD1质粒,用Western blot法检测不同组Notch1与Fascin1的蛋白表达水平。结果:1.Notch1/Fascin1在结肠癌及癌旁组织中的表达情况(1)结肠癌组织中Notch1蛋白阳性率为73.3%(44/60);癌旁组织中阳性表达率为26.7%(16/60),两者比较有显著差异(P<0.05);Notch1在结肠癌中的表达与TNM分期、淋巴结转移呈正相关。(2)结肠癌组织中Fascin1阳性率为55%(33/60),而在癌旁组织中无表达,两者比较有显著差异(P<0.05);Fascin1在结肠癌中的表达与TNM分期、淋巴结转移及肿瘤大小呈正相关。(3)Spearman相关性分析显示,Notch1和Fascin1在结肠癌中表达呈显著正相关(r=0.288,P=0.026)。(4)在6例人结肠癌及癌旁组织中,Western blot结果显示,Notch1与Fascin1在结肠癌中的表达均明显高于癌旁组织。2.结肠癌细胞中,Notch1对Fascin1 mRNA及蛋白表达水平的影响(1)人结肠癌两种细胞系HCT-116与LoVo转染Notch1-siRNA后,Fascin1 mRNA和蛋白水平均明显降低(P<0.05),而Normal组(正常组)与Control-siRNA组无明显变化。(2)HCT-116与LoVo细胞转染NICD1质粒后,NICD1质粒组Fascin1的蛋白表达水平明显增高,而Normal组与对照质粒组(Control plasmid)没有明显变化。结论:1.Notch1与Fascin1在结肠癌中均高表达,具有癌基因的作用,且两者在结肠癌组织中表达呈正相关;2.Notch1能够在转录和蛋白水平控制Fascin1表达。(二)Notch1基因通过Fascin1调控结肠癌细胞侵袭和迁移的研究目的:探讨Notch1通过Fascin1调控结肠癌细胞侵袭和迁移的研究。方法:1.结肠癌HCT-116与LoVo细胞分别转染Control-siRNA、Notch1-siRNA、Notch1-siRNA 与对照质粒(Notch1-siRNA+Control plasmid)、Notch1-siRNA 与 Fascin1 质粒(Notch1-siRNA+Fascin1 plasmid),转染后培养24小时,用Transwell实验检测不同处理组细胞的迁移与侵袭能力。2.HCT-116 与 LoVo 分别转染 Control-siRNA、Fascin1-siRNA,转染后培养24小时,用Transwel实验检测不同处理组细胞的迁移与侵袭能力。结果:1.在结肠癌HCT-116与LoVo细胞中,与Control-siRNA组相比较,Notch1-siRNA组细胞的迁移与侵袭能力均明显下降;与Notch1-siRNA组相比,Notch1-siRNA+Control plasmid共转染组细胞迁移与侵袭能力无明显变化,而Notch1-siRNA+Fascin1 plasmid共转染组细胞迁移与侵袭能力明显提高,可见Fascin1可以挽救Notch1表达下调导致的结肠癌细胞迁移与侵袭能力下降趋势。2.在 HCT-116 与 LoVo 细胞中,与 Control-siRNA 组相比,Fascin1-siRNA 组细胞迁移与侵袭能力均明显降低。结论:Notch1与Fascin1均可促进结肠癌细胞的侵袭与迁移,且Notch1通过靶向Fascin1的表达来调节结肠癌细胞的侵袭与迁移。(三)Notch1基因调控Fascin1基因转录机制的研究目的:在结肠癌细胞中探讨Notch1调控Fascin1基因转录的可能机制。方法:1.以结肠癌细胞HCT-116作为实验对象,染色质免疫共沉淀法(ChIP实验)验证RBP-J k在Fascin1启动子上是否具有结合位点;HCT-116分别在无任何处理、转染Control-siRNA和转染Notch1-siRNA条件下培养24小时,采用ChIP实验检测不同处理因素对RBP-J k与Fascin1启动子结合的影响。2.Control-siRNA 及 Notchl-siRNA 分别转染 HCT-116 细胞,EMSA 实验检测不同处理因素下转录因子RBP-J k DNA结合活性。3.根据转录因子RBP-JK结合位点位置,构建Fascin1两个片段启动子分别为-1466～+114(P1)、-973～+114(P2),报告基因检测Fascin1启动子活性;4.以Fascin1-P2为核心启动子,将2个RBP-J k结合位点碱基序列分别突变、同时突变,构建突变质粒(Fascin1-P2-M1、Fascin1-P2-M、Fascin1-P2-M1-M2),然后分别单独及与RBP-J k质粒共转染细胞,报告基因检测不同组Fascin1启动子活性。5.报告基因方法检测无任何处理组、Control-siRNA组与Notch1-siRNA组的Fascinl启动子活性。结果:1.ChIP实验:(1)当用蛋白特异性抗体RBP-Jk沉淀与蛋白质的复合物时,在样品中能够扩增出条带(Experimental group),而用IgG抗体组(Negative group)不能扩增出明显条带,结果表明在细胞内即RBP-J k在Fascin1启动子上具有结合位点。(2)与正常组、Control-siRNA组相比,Notch-siRNA组的条带信号明显减弱,结果说明Notch1可以调节RBP-Jk在Fascin1启动子上的结合能力,进一步说明Notch1通过转录因子RBP-J k调控的Fascin1转录。2.EMSA 实验:与 Control-siRNA 相比,Notch1-siRNA 组 Notch1 下调可减弱RBP-J k的DNA结合活性。3.双荧光素酶报告基因实验(1)Fascin1-P2荧光活性明显高于Fascin1-P1;(2)结合位点单个突变及同时突变后,Fascin1启动子活性均明显降低。共转染RBP-Jk后,M1组及M2组Fascin1启动子活性降低趋势可以被逆转,但M1-M2同时突变组Fascin1启动子活性降低趋势变化不明显。(3)Notch1表达下调后,Fascin1启动子活性明显降低,RBP-Jk可以逆转Notch1下调导致的Fascin1启动子活性降低趋势。结论:在结肠癌细胞中,Notch1通过转录因子RBP-Jk调控Fascin1转录;Fascin1启动子区域包含2个RBP-Jk结合位点,均可与Fascin1启动子结合;RBP-J k是Fascin1转录调控的正向转录因子。