核糖核酸酶H(RNase H)是一种能有效水解RNA/DNA杂合链中的RNA部分的核糖核酸酶,广泛存在于原核细胞和真核细胞中。核糖核酸酶H在原核细胞中普遍存在,由于其独特的底物特异性,RNase H在DNA复制、基因表达和DNA修复等相关的生物化学过程中发挥着关键作用。作为一类特殊的寡核苷酸,非编码小分子RNA(small non-coding RNA,sRNA)在细胞中通过改变RNA构象、与蛋白质结合、与核酸的相互作用来调控转录、翻译、mRNA稳定性、DNA稳定性及基因沉默,对细胞中的生理生化反应起着重要的调控作用。研究显示,核糖核酸酶在小分子RNA的产生以及加工成熟过程中起着关键性作用,通过调节小分子RNA的周转来控制它们的细胞水平。因此,本研究推测核酸酶H可能与细菌内小分子RNA的调控有关。对大肠杆菌DY329菌株内的RNase HI与RNase HII进行基因敲除,通过RNase H表达缺陷型菌株来对细胞内的小分子RNA进行研究分析。本实验首先将基因敲除获得△rnhA菌株、△rnhB菌株以及△rnhA&△rnhB菌株三种核酸酶H缺陷菌株,与野生型菌株在同样的培养条件下,测定其生长曲线差异,发现敲除后菌株在32℃培养条件下的生长状态与野生型菌株相比,生长状态差异不显著。将四种菌株生长曲线对数期数据进行线性回归分析后发现:野生型菌株生长曲线对数期斜率最大,RNase HI&RNase HII双敲除后的斜率最小;RNase HI敲除菌株的斜率比RNase HII敲除菌株数值大。推测在细菌内,RNase HII敲除比RNase HI敲除的影响更为显著。抽提四种菌株对数生长期总RNA,检测了TFF、ryeA、GlmZ、SgrS及SraF五种小分子RNA的表达量变化水平。结果显示敲除RNase H后的菌株中小分子RNA含量均有变化,其中小分子RNA SraF的变化最为明显,△rnhA&△rnhB双敲除菌株中SraF的表达量则达到了野生型的11.9倍,上调趋势显著。我们认为细菌RNase H与小分子RNA之间确实存在调控关系。同时,本实验在进行小分子RNA的RT-Q-PCR定量测定过程中,为解决有些小分子RNA在细胞内含量较低导致很难被检测出的问题,设计了一种含脱氧尿嘧啶(dU)的新型茎环引物,提升对小分子RNA检测的特异性和灵敏度。我们利用此新型方法检测了大肠杆菌中两个小分子RNA:TFF和ryeA。结果均证实用UDG处理的嵌含dU的新型茎环引物方法能提升对小分子RNA检测的特异性和灵敏度。