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背景:心肌梗死(myocardial infarction,MI)是心功能障碍和猝死的主要原因。心肌梗死后,心室结构重构和神经重构促使心脏形态、结构和功能异常,最终导致心功能障碍、恶性心律失常甚至猝死。因此,延缓、逆转心肌梗死后心室结构重构和神经重构能够改善上述心肌梗死后严重并发症。ActivinA是同源二聚体蛋白并且属于转化生长因子(a member of the transforming growth factor-beta,TGF-β)超家族一员。研究证实,在急性心肌梗死患者中,血清ActivinA浓度增加与血清中肌酐浓度、心肌梗死面积及左室射血分数变化一致[1,2]。在心力衰竭的患者和大鼠心肌梗死后心力衰竭的模型中,ActivinA参与心肌梗死后心力衰竭的病理过程并导致心功能的恶化[3]。在ST段抬高的心肌梗死患者中发现,梗死后6个月,高水平的ActivinA与低的左室射血分数和高的左室舒张末容量有关;而梗死后3年,ActivinA水平大于129pg/ml可以预测ST段抬高的心肌梗死患者的左室重构和全因死亡率[1]。研究也显示,血清高浓度的ActivinA是糖尿病心肌病、扩张性心肌病、瓣膜疾病的关键损害因子[4,5,6,7,8,9]。这些研究强有力的证明了ActivinA参与心血管疾病的病理过程。但ActivinA是否参与心肌梗死后心肌间质重构和神经重构,并且它是通过怎样的机制参与这些病理过程,未见报道。本研究通过结扎SD大鼠冠状动脉前降支诱导心肌梗死模型,同时行rActivinA、ActivinA阻断剂卵泡抑素及MAPKs通路抑制剂处理培养的成年SD大鼠的心脏成纤维细胞(CF),观察内源性ActivinA对心肌梗死后心室重构(间质纤维化和神经重构)和心功能的影响,并进一步探讨其可能机制。第一部分:ActivinA对大鼠心肌梗死后心室重构和心功能的影响目的:由于目前临床和动物实验研究主要针对ActivinA与心肌梗死后心、功能的相关性研究。因此,我们阻断内源性ActivinA进一步观察它是否可以调控SD大鼠心肌梗死后心室重构和心功能。方法:通过结扎SD大鼠冠状动脉前降支诱导心肌梗死模型,把术后第一天所有存活的大鼠随机分成三组并给予治疗,假手术组(冠状动脉前降支只穿线不结扎冠状动脉),心梗对照组(腹腔注射羧甲基纤维素钠)和卵泡抑素组(腹腔注射ActivinA特异性抑制剂卵泡抑素)。不同时间点统计大鼠的生存率;术后4周,测量三组大鼠的基本指标:体重、心率、相对肺脏体重比及相对心脏体重比;同时,心脏超声评估心脏结构的变化和血流动力学评估心脏功能的变化;苏木素(HE)染色观察心肌组织结构的变化。结果:(1)三组大鼠的生存率、体重、心率、平均动脉压无显著差异(p>0.05);(2)与假手术组肺脏/心脏体重比相比,心梗对照组大鼠明显升高(p<0.05),而卵泡抑素组较心梗对照组降低(p<0.05);(3)心梗对照组大鼠心脏超声指标及血流动力学指标较假手术组明显恶化(p<0.05),而卵泡抑素组较心梗对照组明显改善(p<0.05);(4)HE染色切片结果显示,与假手术组相比较,心梗对照组梗死区呈透壁性心肌梗死且明显变薄、可见少量的残存的心肌细胞,而梗死周边区心肌梗细胞代偿性肥大(p<0.05);针对于梗死面积,卵泡抑素组较心梗对照组明显减小(p<0.05)。结论:抑制内源性ActivinA能够改善大鼠心肌梗死后心室重构和心功能障碍。第二部分:ActivinA对大鼠心肌梗死后心肌间质纤维化的影响及机制研究目的:心肌梗死后激活的CF增值和分化成成肌纤维细胞,这种细胞将会合成和释放大量的细胞外基质,例如胶原Ⅰ(collagenⅠ)和胶原Ⅲ(collagenⅢ),导致心肌梗死后心肌间质纤维化[10,11,12]。有研究报道,ActivinA能够诱导人类肺成纤维细胞、肾脏成纤维细胞和NRK-49F细胞的增值与分化[13,14],而且,阻断内源性ActivinA能够减轻博来霉素诱导的大鼠肺纤维化和CCL4诱导的大鼠肝纤维化[15,16]。因此,我们推测阻断内源性ActivinA可能通过抑制心肌梗死后激活的CF的增值与分化,从而减弱心肌梗死后心肌间质纤维化,进而改善心室结构重构,逆转心肌梗死后心功能障碍。本实验研究的目的是观察内源性ActivinA是否能够调控大鼠心肌梗死后心肌间质纤维化以及它调控的可能机制。方法:通过结扎SD大鼠的冠状动脉前降支诱导心肌梗死模型,把术后第一天所有存活的大鼠随机分成三组,假手术组(冠状动脉前降支只穿线不结扎冠状动脉),心梗对照组(腹腔注射羧甲基纤维素钠)和卵泡抑素组(腹腔注射ActivinA特异性抑制剂卵泡抑素)。术后4周,存活的SD大鼠行心脏超声及血流动力学检测完毕,麻醉,迅速心脏采血和收集心脏标本。(1)Masson染色观察梗死周边区心肌间质纤维化;(2)免疫荧光染色观察心肌梗死后CF的增值;Western blot法检测梗死周边区α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin;α-SMA)、collengenⅠ、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)及丝裂原活化蛋白激酶p38(p38-MAPK)信号通路相关蛋白表达。除此之外,使用ActivinA、ERK1/2和p38-MAPK的抑制剂和重组ActivinA(recombinant ActivinA;rActivinA)处理培养的成年 SD 大鼠 CF 后留取标本进一步验证ActivinA的致纤维化作用。实验方法:CCK8及EdU实验检测CF的增殖,Western blot 法检测α-SMA、collengenⅠ、p-ERK1/2 及 p-p38-MAPK 的蛋白表达。结果:(1)针对于动物模型,与假手术组比较,心梗对照组梗死周边区大量的胶原纤维增生;CF大量增值;collengenⅠ、p-ERK1/2和p-p38-MAPK蛋白表达明显升高(P<0.05),而卵泡抑素组治疗则可逆转上述效应(P<0.05)。(2)针对于细胞模型,正常成年大鼠的CF表达和分泌ActivinA,而且,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)明显促进ActivinA的表达和分泌(P<0.05),而卵泡抑素明显逆转这种效应(P<0.05)。而且,与AngⅡ组相比,卵泡抑素能够下调AngⅡ诱导的CF的增值与分化、collengenⅠ的表达、ERK1/2和p38-MAPK通路的活性(P<0.05)。进一步研究发现,在基础或是AngⅡ诱导的CF中,rActivinA能够上调CF的增值、分化、collengenⅠ的表达、ERK1/2和p38-MAPK通路的活性(P<0.05),有趣地是,SB203580(p38-MAPK抑制剂)和SB431542(ALK4抑制剂,ALK4是ActivinA特异性受体)明显逆转上述效应(P<0.05);而PD98059(ERK1/2抑制剂)只能够减弱CF的增值和collengenⅠ的表达(P<0.05)而对分化没有影响(P>0.05)。重要的是,AngⅡ处理的模型相对于正常细胞模型变化的更加明显(P<0.05)。结论:阻断内源性ActivinA可以改善心肌梗死后心肌间质纤维化,它的潜在作用机制可能是通过抑制心肌梗死后激活的ERK1/2和p38-MAPK信号通路进而减弱心肌梗死后CF的增值与分化而发挥作用。第三部分:ActivinA对大鼠心肌梗死后神经重构的影响及机制研究目的:炎症反应在心肌梗死后交感神经重构的过程中发挥重要作用,而交感神经重构是心肌梗死后心律失常和猝死的基本机制[17]。ActivinA是一种二聚体蛋白,在细胞的炎症和免疫调控中发挥重要作用[18]。ActivinA能够激活核因子-kB(NF-kB)通路[19]而且NF-kB通路也能促进ActivinA的产生[20]。重要地是,抑制NF-kB通路能够逆转心肌梗死后炎症介导的左室重构和心功能障碍[21]。研究也发现,rActivinA能够促进纹状体细胞的络氨酸羟化酶(TH)表达[22],同时也能诱导多巴胺基因转录进而分泌去甲肾上腺素[23]。所以,我们推测ActivinA可能通过NF-κB通路促进炎症反应进而导致心肌梗死后神经重构。本实验研究目的观察内源性ActivinA是否能够调控大鼠心肌梗死后梗死周边区阳性的巨噬细胞(ED1)和α-SMA为主的肌成纤维细胞的浸润、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha;TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β;IL-1β)的蛋白表达以及NF-kB炎症信号通路的活性。方法:把术后第一天所有存活的大鼠随机分成三组,假手术组(冠状动脉前降支只穿线不结扎冠状动脉),心梗对照组(腹腔注射羧甲基纤维素钠)和卵泡抑素组(腹腔注射ActivinA特异性抑制剂卵泡抑素)。术后4周,存活的SD大鼠行心肌脏超声及血流动力学检测完毕,麻醉,迅速心脏采血和收集心脏标本。(1)免疫组织化学法检测梗死周边区ED1、α-SMA、络氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)、生长相关蛋白(growth associated protein 43,GAP43)阳性表达的细胞;(2)western blot法检测梗死周边区心肌组织IL-1β、TNF-α、p-p 65和p-IkBa的蛋白表达;(3)western blot法检测梗死周边区神经重构因子TH、GAP43和神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)的蛋白表达。结果:(1)心梗对照组心脏组织梗死周边区ED1阳性巨噬细胞和α-SMA阳性的肌成纤维细胞较假手术组浸润明显增多(p<0.05),而卵泡抑素组ED1阳性细胞和α-SMA阳性细胞浸润较心梗对照组减少(p<0.05)。(2)与假手术组相比,心肌梗死后梗死周边区心肌组织IL-1β、TNF-α、p-p65和p-IkBa的蛋白水平升高(p<0.05),而卵泡抑素组明显低于心梗对照组(p<0.05)。(3)与假手术组相比,心梗对照组TH、GAP43和NGF 水平增加,而卵泡抑素组较心梗对照组明显降低(p<0.05)。结论:阻断内源性ActivinA能够抑制NF-kB信号通路活性,从而降低心肌梗死后炎症反应,改善心肌梗死后神经重构。