随着结构生物学的发展和计算机辅助药物设计技术的进步，许多与疾病相关的天然受体三维晶体结构得到解析和确认，使得人们能够更为准确地研究受体与配体分子之间的相互作用，也为进一步开发新颖的配体分子提供了理论依据。作为G蛋白偶联受体(Guanosine-binding Protein Coupled Receptor，GPCR)超家族中的一员，CXC趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor type4，CXCR4)在体内的大部分组织或器官均有表达，并在恶性肿瘤及转移灶中高度表达。CXCR4在人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)侵染细胞、肿瘤迁移、造血功能以及胚胎发育等方面起着重要作用。目前，CXCR4受体研究的热点主要集中于特异性配体分子的筛选和下游信号通路机理的研究。现已证实CXCR4受体在生理状态下主要是以二聚体形式存在，而已发现的配体分子仅针对CXCR4的单个受体。所以，本文根据CXCR4受体的二聚体结构，借助计算机辅助设计和化学手段，进行了配体分子的设计与合成，得到了一系列二聚体多肽。体外活性筛选表明，两个多肽分子显示了很高的受体结合活性、而且能够影响细胞的迁移和钙离子的释放，具有一定的研究价值，这也是本文的创新点。本文设计合成了三类共三十条二聚体多肽分子，其中二十八条为首次设计合成得到。第一类包含十八条多肽，是以十肽分子DV3为单体得到的一系列同源二聚体分子。十肽分子DV3为本实验室首次设计与合成的多肽。本文借助计算机辅助设计手段，测量出CXCR4晶体结构中两个活性位点之间的直线距离。然后，本文还根据此距离选择不同的连接物，如烷烃、氨基酸和低分子量聚乙二醇(PEG)等对DV3进行了二聚化合成。同时本文对合成的二聚体多肽进行了体外活性筛选，得到以两分子PEG3为优势连接物的二聚体分子(DV3-PEG3)2K。该多肽分子具有很高的CXCR4受体结合活性，能够在很低的浓度下抑制肿瘤细胞的迁移，并且能够阻断CXCR4下游信号通路中的钙离子释放。此外，本文通过氨基酸序列突变和增减PEG连接物的长度等手段，对DV3序列中的羧基端进行了构效关系的研究，为DV3与受体作用方式以及进一步的共结晶研究提供了依据。第二类包含七条多肽，是以CXCR4的天然配体SDF-1α(stromal-derived-factor-1α)氨基端前八位氨基酸序列SDF-1α1-8为单体得到的同源二聚体分子。本文首先分别采用氨基酸、高分子量PEG和低分子量PEG为连接物对SDF-1α1-8进行二聚化。实验研究表明所得到的二聚体多肽与CXCR4受体的结合活性均很低。这也证实了SDF-1α氨基端序列难以达到全序列的受体结合活性，而羧基端序列在受体结合中同样具有重要作用。第三类包含五条多肽，是以DV3和SDF-1α1-8聚合得到的异源二聚体分子。本文选取低分子量PEG为连接物进行二聚化，得到具有中等CXCR4受体结合活性的二聚体多肽。在此类二聚体中，以两分子PEG3为连接物的多肽分子DV3-PEG3-K-(PEG3-SDF1α1-8)保留了DV3的受体结合活性。该多肽也具有良好的CXCR4激动活性，能够在纳摩尔浓度下促进体外肿瘤细胞的迁移以及CXCR4介导的下游信号通路中钙离子释放。此配体分子采用组合化学的思路进行了异源聚合，且收到良好的重组效果，也为下一步CXCR4激动剂先导化合物的研究提供了依据。在上述二聚体多肽的活性研究中，所合成的多肽分子均通过竞争性结合实验进行了受体结合能力检测。由于二聚体多肽数量多，且所用竞争性实验方法复杂，本课题组耗费了大量的时间来完成受体结合能力的测定。为了简化实验进程和降低工作难度，本文开始寻求一种简捷且有效的竞争性结合实验方法。作为一种评价配体与受体结合能力的重要实验，竞争性结合实验的灵敏度和简捷度直接关系到实验结果准确性和实验速度。因此，一种灵敏准确且方便快捷的实验方法对于配体分子研究就显得至关重要。目前，竞争性结合实验中经常使用的两种方法是放射性元素标记法和12G5方法。放射性元素标记法是利用放射性元素标记的配体125I-SDF-1α作为被竞争的探针分子，检测与受体结合的配体分子的放射性强度。12G5方法首先利用抗CXCR4单克隆抗体12G5作为一抗与受体结合，然后加入荧光基团标记的二抗分子结合一抗，最后检测二抗分子的荧光强度。放射性元素标记法简单但放射性对实验人员具有伤害，而12G5方法安全但操作繁琐，实验过程耗时长。在竞争性结合实验中，荧光探针分子是实验方法的关键。因此，本文在具有良好CXCR4受体结合活性的多肽DV1羧基端引入连接物，再标记荧光基团FITC，得到新型荧光多肽分子FITC-DV1。该荧光分子具有适中的受体饱和浓度阈值、良好的受体选择性和受体结合常数(Ki)，在CXCR4竞争性结合实验中与12G5双抗体分子具有相同的荧光探针功能。荧光多肽分子FITC-DV1提供了一种新的CXCR4竞争性结合实验方法，简化了实验步骤，具有很好的应用价值，这是本文的第二个创新点。