A型流感病毒可感染人、猪、鸡、鸭等多种哺乳动物以及禽类。其中,猪流感病毒可在猪群中引起急性、高度接触传染性的呼吸道感染,导致患病猪生产性能下降,造成极大的经济损失。此外,猪是多种来源流感病毒的共同易感宿主,成为毒株间基因重组的“混合器”,具有很重要的公共卫生意义。引起21世纪第一次流感大暴发的新型甲型H1N1/2009流感病毒即是起源于猪流感病毒的人、猪、禽三源重组流感病毒,对人类健康构成极大的威胁。因此,加强流感病毒的防控对社会经济、动物和人类健康均具有十分重要的意义。微小RNA（microRNA,简称miRNA）是一类大小约22个核苷酸的内源性非编码单链RNA小分子,通过RNA干扰途径在转录后水平调控宿主基因的表达,广泛参与机体的生物学过程。近年来,miRNA参与流感病毒感染的研究受到越来越多的关注,然而,目前的研究多集中于人、鼠、鸡等物种的miRNA对人流感病毒及禽流感病毒的调控上,关于猪miRNA在猪流感病毒的感染过程中发挥怎样的调控作用知之甚少。因此,本研究第一部分拟筛选调控猪甲型H1N1/2009流感病毒（SIV-H1N1/2009）感染的猪miRNA,并阐明其生物学功能及作用机制。宿主蛋白在流感病毒的感染中亦发挥着重要的调控作用,例如,流感病毒的核糖核蛋白复合体需要与一些宿主蛋白发生相互作用才能介导病毒RNA的转录和复制。有研究小组利用酵母双杂交技术筛选到宿主蛋白-增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）可能同流感病毒的聚合酶亚基存在互作关系,提示PCNA可能参与调控流感病毒的复制。此外,有研究发现,与PCNA互作的多肽可减少Akt的磷酸化以及Toll样受体介导的细胞因子分泌,提示PCNA可能在细胞信号通路中也发挥着一定的功能。因此,本研究的第二部分从宿主蛋白PCNA调控流感病毒聚合酶功能和天然免疫反应两个方面对PCNA调控流感病毒复制的分子机制进行了初步研究。具体研究内容如下:1.猪mi RNA表达谱芯片及基因表达谱芯片的生物信息学分析SIV-H1N1/2009 感染新生猪气管上皮细胞（new-born pig trachea,NPTr）后,miRNA表达谱芯片鉴定到66个差异表达的miRNA,其中9个miRNA上调表达,57个miRNA下调表达;同时,基因表达谱芯片鉴定到166个可进行功能注释的差异表达基因,89个基因上调表达,77个基因下调表达。利用已有文献资料及生物信息学分析共鉴定到14个表达呈负相关的miRNA-基因靶对,可能参与SIV-H1N1/2009的复制过程。2.miRNA通过靶向宿主基因间接调控SIV-H1N1/2009的复制对鉴定到的14个miRNA-基因靶对进行综合分析后,将研究工作聚焦在了ssc-miR-361-3p 和宿主基因-pole 样激酶 3（pole-like kinase 3,PLK3）上。首先双荧光素酶报告实验的结果显示ssc-miR-361-3p可直接靶向PLK3的3’UTR区,并在mRNA水平和蛋白水平抑制PLK3的表达;SIV-H1N1/2009在感染过程中通过下调ssc-miR-361-3p的水平而上调PLK3的表达;之后,PLK3被证实同样对SIV-H1N1/2009的复制具有正调控作用,而ssc-miR-361-3p抑制SIV-H1N1/2009的复制;同时验证了 ssc-miR-361-3p不靶向被预测到的另一个差异宿主基因-高迁移率蛋白家族A1（high mobility group AT-hook 1,HMGA1）,也不靶向病毒的基因组,进一步证实了 ssc-miR-361-3p对SIV-H1N1/2009发挥负调控作用在一定程度上是通过靶向宿主基因PLK3。此外,对预测到的其他miRNA-基因靶对进行了初步验证,发现ssc-miR-339-5p可能通过靶向宿主基因-v-myb成髓细胞性白血病病毒癌基因同源物（禽）样 2（v-myb myeloblastosis viraloncogene homolog（avian）-like 2,MYBL2）对SIV-H1N1/2009的复制发挥负调控作用,具体机制有待进一步研究。3.m RNA通过靶向病毒基因组直接影响SIV-H1N1/2009的复制对靶向SIV-H1N1/2009基因组的miRNA进行了全面预测,共筛选到22个miRNA结合位点,通过双荧光素酶报告实验初步鉴定到ssc-miR-204和ssc-miR-4331分别靶向病毒基因-血凝素（hemagglutinin,HA）和非结构蛋白（nonstructuralprotein,NS）,具体结合位点分别位于HA1和NS1;之后的工作证实了 ssc-miR-204和ssc-miR-4331通过分别抑制HA1和NS1的表达对SIV-H1N1/2009的复制发挥负调控功能,且这种负调控机制具有毒株序列特异性。同时,检测到SIV-H1N1/2009在感染过程中反过来下调ssc-miR-204和ssc-miR-4331的表达,弱化它们对病毒复制的抑制作用,利于病毒自身在宿主中的增殖。4.宿主蛋白PCNA通过影响流感病毒聚合酶功能调控病毒的复制本研究首先利用免疫共沉淀的方法证实了 PCNA同聚合酶亚基-碱性聚合酶2（polymerase base 2,PB2）及碱性聚合酶 1（polymerase base 1,PB1）的互作关系;之后发现PCNA能够同输入蛋白α5亚基（importin alpha 5,importin-α5）竞争结合PB2的C端,致使PB2入核减少,流感病毒核糖核蛋白复合体的组装过程受阻,最后导致聚合酶活性降低,流感病毒的复制受到抑制。反过来,流感病毒感染可降低PCNA的表达水平,与之有互作关系的PB2及PB1可能在其中起主要作用,具体机制尚不清楚。5.宿主蛋白PCNA对宿主天然免疫反应的调控此外,研究发现宿主蛋白PCNA还可以促进仙台病毒刺激的干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3,IRF3）的磷酸化水平,进而上调干扰素的产生,通过调控宿主天然免疫反应影响流感病毒的复制。反过来,干扰素可诱导PCNA的表达。进一步研究发现,PCNA可与维甲酸诱导基因Ⅰ型（retinoic acid inducible gene I,RIG-I）样受体信号通路中的接头分子-线粒体抗病毒信号蛋白（mitochondrialantiviral signaling protein,MAVS）、IκB 激酶 ε 亚基（I-kappaB kinase epsilon,IKKε）、肿瘤坏死因子受体相关蛋白 3（tumor necrosis factor receptor associated factor 3,TRAF3）、肿瘤坏死因子受体相关蛋白 6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6,TRAF6）发生相互作用。其中,TRAF3的TRAF区是TRAF3与PCNA互作所必须的。但PCNA既不影响这四个接头分子的表达量,也不影响接头分子间的招募,其对宿主天然免疫反应的正调控作用机制尚不清楚。本研究首次探索了猪miRNA在猪源细胞系上对猪流感病毒的调控作用,成功筛选到对SIV-H1N1/2009的复制发挥负调控功能的ssc-miR-361-3p、ssc-miR-339-5p、ssc-miR-204及ssc-miR-4331,初步阐明了其作用机制;同时,对宿主蛋白PCNA调控流感病毒聚合酶功能及宿主天然免疫反应进行了初步研究,为抗流感病毒药物研发提供候选靶标和理论依据。