脊髓小脑共济失调3型(spinocerebellar ataxia type3;SCA3)是临床中最常见的显性遗传性脊髓小脑共济失调.因为ATXN3基因中CAG三核苷酸重复序列增多,导致翻译后蛋白谷氨酰胺肽链(polyglutamine;polyQ)延长进而引导疾病发生是该疾病最根本的致病原因.长期以来针对该疾病的致病机制研究从未停止,但是至今为止缺乏一种很明确的结论.针对该疾病的治疗目前也仅仅局限于针对临床症状的非特异性治疗,并不能阻止疾病的发生与发展.　　长期以来人们采用疾病特异性的成纤维细胞,过表达细胞以及转基因动物作为疾病模型用于SCA3疾病机制及治疗的研究工具.但是都存在一定的缺陷,如遗传背景差异,疾病表型欠佳.而近年来如火如荼的诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells;iPSCs)技术无疑给疾病研究提供了一项新的途径.来源于病人特异性的体细胞经过重编程可形成具有类似胚胎干细胞特性的细胞,因其具有自我更新和定向分化能力,可形成大量具有相同遗传背景的分化细胞,从而在疾病模型,药物筛选,干细胞替代治疗有良好的应用前景.　　鉴于SCA3是一种毒性获得效应导致的单基因遗传病,采用基因沉默手段降低致病基因的表达显示出良好的应用前景.既往研究主要采用单链反义RNA或寡核苷酸链进行RNA干扰或外显子跳跃的手段从而降低致病基因的表达.但是其存在低选择性,低特异性,低持久性等缺陷.并且ATXN3是一种保守且广泛表达的去泛素化酶,其在蛋白降解等过程中扮演者重要的角色,所以迫切需要寻找一种更好的方法去特异性的降低或沉默致病蛋白.　　CRISPR/Cas9作为一种新型的基因编辑技术,因其操作性强,基因编辑效率较高等优势受到大家的广泛追捧.CRISPR/Cas9诱导产生的双链断口可通过同源末端重组修复和非同源末端连接修复(non-homologous end joining;NHEJ)两条途径来修复,从而进行基因编辑.其中大片段核苷酸的切除或缺失可通过NHEJ的途径实现.所以采用CRISPR/Cas9结合SCA3病人特异性iPSCs,靶向性针对ATXN3基因致病核心序列的CAG重复区进行切割,并探讨修复后iPSCs进一步分化到神经元后其表型功能有无改变,从而为SCA3疾病的研究和治疗提供参考.　　第一部分 非整合SCA3病人来源诱导性多能干细胞系的建立　　目的:　　建立SCA3病人特异性的iPSC系,评估其多能性及基因组稳定性,并作为疾病模型用于后续的基因编辑研究.　　方法：　　使用仙台病毒介导4种转录因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)诱导SCA3患者外周血单个核细胞,将其重编程为疾病特异性诱导性多能干细胞,并进行分子分型,多能性检测,体内外分化能力及定向神经分化能力评估.　　结果：　　成功建立了SCA3疾病特异性iPSCs,其保持疾病特异性分子表型,具有类似于胚胎干细胞的克隆形态,碱性磷酸酶染色阳性,多能性基因表达,具有体内外的分化能力,能定向分化到神经干细胞及神经元.　　结论：　　该方法建立的SCA3病人来源iPSCs既保留有疾病特异性分子表型,又具有干细胞特性,能定向分化到神经细胞,可作为细胞模型用于后续的基因编辑及功能学研究.　　第二部分 利用CRISPR/Cas9去除SCA3-iPSCs异常CAG重复序列　　目的:　　人ATXN3中异常CAG重复数增多导致ATXN3中羧基端多聚谷氨酰胺肽链(polyglutamine;polyQ)延长是SCA3疾病的根本病因.采用CRISPR/Cas9靶向去除SCA3病人特异性iPSCs中的CAG重复数,并进一步观察其在分化细胞中的表型.　　方法：　　针对人ATXN3基因10号外显子CAG重复序列上下游分别设计两条向导RNA(guide RNA;gRNA),并构建对应的CRISPR/Cas9-gRNA质粒,分别进行gRNA切割效率和脱靶效应评估,随后将双质粒与SCA3-iPSCs进行共转染,通过流式分选,PCR及测序等方法筛选到异常CAG重复数被切割去除的目的克隆.针对编辑后克隆进行多能性鉴定、定向神经分化和基因组稳定性评估.　　结果：　　gRNA1和gRNA2均具有较好的切割效率,且在预测的脱靶位点上并未观察到非特异性切割.双gRNA切割可去除异常CAG重复序列,形成的基因编辑后干细胞克隆仍保留多能性,能定向分化到神经元,且在不同分化阶段的细胞均保留特异性分子表型和基因组稳定性.　　结论：　　利用CRISPR/Cas9技术结合SCA3病人特异性iPSC可以获得ATXN3基因中异常CAG重复数切除的iPSCs,该模型可用于评估异常CAG重复数去除后ATXN3蛋白功能和SCA3疾病表型的改变.　　第三部分 ATXN3异常CAG重复序列去除后的细胞功能学研究　　目的:　　人ATXN3是一种去泛素化酶,具有泛素结合和去泛素化功能.靶向去除ATXN3中异常CAG重复区后,ATXN3结构会发生改变,而编辑后ATXN3的正常功能是否保留,SCA3疾病表型是否逆转值得关注.　　方法：　　采用生物信息学分析预测基因编辑后ATXN3蛋白一级结构,采用Western blot检测编辑前后细胞ATXN3蛋白的表达情况,并在分化后的神经细胞中采用免疫共沉淀技术检测ATXN3泛素结合能力,采用氧耗率代谢实验检测编辑前后神经细胞线粒体功能变化.　　结果：　　ATXN3中异常CAG重复序列去除后,形成了一条新的不含异常多聚谷氨酰胺肽链的截短型蛋白,虽不含有第三泛素结合组件(ubiquitin interacting motifs3;UIM3),但仍保留有Josephin区,UIM1、UIM2和含缬酪肽蛋白结合组件等重要的功能区域.包含截短型蛋白的编辑后ATXN3蛋白仍具有与全长ATXN3相类似的泛素结合能力.在包含基础呼吸率,最大呼吸率和ATP产量的线粒体功能代谢等指标检测中,编辑后神经元同正常人iPSCs分化神经元一样相比编辑前SCA3神经元具有更高的能量代谢水平.　　结论：　　利用CRISPR/Cas9技术去除ATXN3中异常CAG重复区后,生成了一新的包含正常位点和截短型位点的不包含异常polyQ肽链的基因编辑后蛋白.功能学实验证实编辑后蛋白具有正常的泛素结合能力,并且基因编辑后的神经元相比编辑前线粒体功能有明显改善.这都预示着异常CAG重复序列的去除是有利的.