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蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage, SAH)是一种神经系统急危重症，主因颅内动脉瘤破裂所致，具有高死亡率和高致残率的特点。近年来越来越多的研究证据表明，导致SAH患者预后不佳的主要原因是早期脑损伤(early brain injury, EBI)。EBI是指SAH后72小时内发生的脑损伤，是由血液及其分解产物在蛛网膜下腔对全脑组织造成的直接损伤。目前研究初步证实EBI涉及的主要病理机制包括：炎症反应、缺氧、氧化应激和兴奋性毒性等。然而，目前针对EBI临床上缺乏有效的防治措施。因此，积极探索EBI发生的机制并进一步寻找新的治疗靶点，具有重大的临床意义。我们前期研究发现，EBI谷氨酸兴奋性毒性损伤与星形胶质细胞上表达的谷氨酸转运体GLT1的表达下调直接相关，提示特异性地上调星形胶质细胞上GLT1的表达和功能可能是EBI干预的有效策略。因此，探讨SAH后星形胶质细胞中GLT1表达调控的分子机制，探寻特异性的分子靶点以干预SAH后GLT1的表达下调，可能为EBI的早期靶向治疗提供重要的实验依据。最新研究发现，星形胶质细胞特异性表达的应激反应基因NDRG2在多种神经系统疾病模型中参与间质谷氨酸稳态的调节，提示NDRG2可能参与了SAH后GLT1的表达调节。本课题拟针对SAH后EBI的兴奋性毒性机理，围绕星形胶质细胞谷氨酸调节功能和GLT1表达调控开展机制研究和脑保护策略探索。我们首先通过SAH动物模型和NDRG2基因敲除小鼠明确SAH后NDRG2与GLT1的表达模式，并通过SAH离体实验揭示星形胶质细胞中NDRG2调节GLT1表达的分子机制及其对神经元兴奋性毒性的作用，为NDRG2作为EBI早期干预的有效靶点提供依据。
根据以上研究背景和科学假设，我们拟开展以下三部分的研究内容：
第一部分，探讨SAH后EBI期NDRG2与GLT1在脑内的时空表达模式。采用血管内穿刺的SAH小鼠模型，通过免疫荧光染色和Westernblot等实验检测EBI不同时间6h、12h、24h、48h、72h脑内皮层和海马区NDRG2分别在神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞等不同神经细胞亚型中的定位及表达水平，证实SAH后NDRG2特异性表达于星形胶质细胞中，并与GLT1的表达水平呈负相关趋势。同时通过Garcia神经功能评分、脑水含量测定方法，证实SAH后不同时间小鼠的神经功能损伤程度和脑水肿程度与NDRG2的表达呈正相关趋势。这些结果提示NDRG2可能与SAH后EBI密切相关。
第二部分，明确敲除NDRG2在SAH后EBI中的神经保护作用。采用CMV-NDRG2基因敲除小鼠，构建SAH模型，通过FJC染色、TUNEL染色等形态病理实验检测NDRG2敲除对EBI神经细胞存活的影响，通过Garcia神经功能评分检测NDRG2敲除对SAH动物的神经功能的影响，明确NDRG2敲除能够减轻SAH后EBI神经损伤，改善动物神经功能。离体采用OxyHb处理原代星形胶质细胞模拟SAH后血液成分对星形胶质细胞的损伤作用，分别上调、下调NDRG2，通过谷氨酸浓度测定检测OxyHb处理后星形胶质细胞对谷氨酸的摄取能力，通过TUENL染色检测与星形胶质细胞共培养的神经元的凋亡情况，进而明确抑制NDRG2可以减轻SAH后星形胶质细胞介导的谷氨酸兴奋性毒性损伤作用。
第三部分，探寻SAH后星形胶质细胞中NDRG2对GLT1转录表达调控的分子机制。采用OxyHb处理原代星形胶质细胞，通过蛋白和RNA水平检测OxyHb处理后及NDRG2上调、下调后对GLT1表达的影响，明确OxyHb处理后NDRG2负向调节星形胶质细胞GLT1的表达。进一步通过蛋白胞浆胞核分离、免疫共沉淀(Co-IP)和免疫荧光染色实验，观察OxyHb处理后NDRG2与NF-κBp65结合及对其核转位的作用，明确OxyHb刺激情况下，NDRG2能够入核与GLT1的重要转录因子NF-κBp65结合。同时通过蛋白-DNA结合实验(凝胶迁移实验，EMSA)和荧光素酶报告基因实验(Luciferase reporter)检测NDRG2不同表达水平对NF-κBp65与DNA结合能力，及对GLT1启动子转录活性的影响。据此初步证实在模拟SAH离体刺激状态下，NDRG2可能通过结合并影响NF-κBp65的转录活性而负性调节GLT1的表达。
综上所述，通过在体和离体实验，我们证实了星形胶质细胞中NDRG2和GLT1的相反表达模式，同时NDRG2敲除可以减轻小鼠SAH后的脑组织损伤和细胞凋亡，并且发现NDRG2基因敲除可以维持GLT1的较高水平。进一步通过机制探索，我们发现在SAH状态下NDRG2可能通过与NF-κBp65结合来抑制GLT1基因的转录，进而抑制星形胶质细胞的谷氨酸摄取能力，诱发神经元死亡。本研究为靶向抑制NDRG2可能作为对SAH等出血性脑卒中潜在的治疗策略提供了实验证据，并提出NDRG2可能通过NF-κB信号通路调节GLT1表达的机制。
根据以上研究背景和科学假设，我们拟开展以下三部分的研究内容：
第一部分，探讨SAH后EBI期NDRG2与GLT1在脑内的时空表达模式。采用血管内穿刺的SAH小鼠模型，通过免疫荧光染色和Westernblot等实验检测EBI不同时间6h、12h、24h、48h、72h脑内皮层和海马区NDRG2分别在神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞等不同神经细胞亚型中的定位及表达水平，证实SAH后NDRG2特异性表达于星形胶质细胞中，并与GLT1的表达水平呈负相关趋势。同时通过Garcia神经功能评分、脑水含量测定方法，证实SAH后不同时间小鼠的神经功能损伤程度和脑水肿程度与NDRG2的表达呈正相关趋势。这些结果提示NDRG2可能与SAH后EBI密切相关。
第二部分，明确敲除NDRG2在SAH后EBI中的神经保护作用。采用CMV-NDRG2基因敲除小鼠，构建SAH模型，通过FJC染色、TUNEL染色等形态病理实验检测NDRG2敲除对EBI神经细胞存活的影响，通过Garcia神经功能评分检测NDRG2敲除对SAH动物的神经功能的影响，明确NDRG2敲除能够减轻SAH后EBI神经损伤，改善动物神经功能。离体采用OxyHb处理原代星形胶质细胞模拟SAH后血液成分对星形胶质细胞的损伤作用，分别上调、下调NDRG2，通过谷氨酸浓度测定检测OxyHb处理后星形胶质细胞对谷氨酸的摄取能力，通过TUENL染色检测与星形胶质细胞共培养的神经元的凋亡情况，进而明确抑制NDRG2可以减轻SAH后星形胶质细胞介导的谷氨酸兴奋性毒性损伤作用。
第三部分，探寻SAH后星形胶质细胞中NDRG2对GLT1转录表达调控的分子机制。采用OxyHb处理原代星形胶质细胞，通过蛋白和RNA水平检测OxyHb处理后及NDRG2上调、下调后对GLT1表达的影响，明确OxyHb处理后NDRG2负向调节星形胶质细胞GLT1的表达。进一步通过蛋白胞浆胞核分离、免疫共沉淀(Co-IP)和免疫荧光染色实验，观察OxyHb处理后NDRG2与NF-κBp65结合及对其核转位的作用，明确OxyHb刺激情况下，NDRG2能够入核与GLT1的重要转录因子NF-κBp65结合。同时通过蛋白-DNA结合实验(凝胶迁移实验，EMSA)和荧光素酶报告基因实验(Luciferase reporter)检测NDRG2不同表达水平对NF-κBp65与DNA结合能力，及对GLT1启动子转录活性的影响。据此初步证实在模拟SAH离体刺激状态下，NDRG2可能通过结合并影响NF-κBp65的转录活性而负性调节GLT1的表达。
综上所述，通过在体和离体实验，我们证实了星形胶质细胞中NDRG2和GLT1的相反表达模式，同时NDRG2敲除可以减轻小鼠SAH后的脑组织损伤和细胞凋亡，并且发现NDRG2基因敲除可以维持GLT1的较高水平。进一步通过机制探索，我们发现在SAH状态下NDRG2可能通过与NF-κBp65结合来抑制GLT1基因的转录，进而抑制星形胶质细胞的谷氨酸摄取能力，诱发神经元死亡。本研究为靶向抑制NDRG2可能作为对SAH等出血性脑卒中潜在的治疗策略提供了实验证据，并提出NDRG2可能通过NF-κB信号通路调节GLT1表达的机制。