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一、研究目的及背景细胞色素P450（cytochrome,CYP450）是药物代谢中一类重要的代谢酶,约60%普通处方药需要通过P450酶进行生物转化。而在P450中最重要的就是CYP3A亚家族,它们是哺乳动物体内药物生物转化的主要酶系,参与内源性物质的生物合成、代谢以及外源性物质的氧化代谢。一直以来,P450酶的基因调控研究的难题是在体外没有一个有代表性的动物代谢模型模拟人P450酶的各个水平的变化。目前实验动物模型大多只能在某一代谢反应上近似地模拟人类,但与人总有一些差异。小鼠是目前常用的药物临床前安全性评价模式动物,但由于P450酶的种属差异,从而限制了小鼠试验结果的前瞻性与可比性。为了克服种属差异,建立表达人P450酶的人源化转基因小鼠是目前常用的策略,但小鼠内源性P450酶可显著地干扰所转入的人P450酶的功能,极大限制了此类模型的应用。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指由内源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA （double-stranded RNA,dsRNA）介导、在细胞内特异地降解靶基因mRNA、从而致使靶基因表达降低或封闭的生物学过程。若能通过以小鼠3A亚家族P450酶基因保守序列中与人3A亚家族P450酶基因编码序列同源性低的差异位点为RNA干扰靶点,构建miRNA分子表达载体,建立体内RNA干扰转基因小鼠模型,在不影响所转入的人P450酶表达的前提下,在小鼠体内特异性、整体性地抑制内源性3A亚家族P450酶的表达,由此消除小鼠内源性P450酶对所转入的人P450酶功能的干扰,为建立一系列人源化程度更高的人3A亚家族P450酶转基因小鼠提供工具小鼠,则其药物代谢过程将和人类非常相似,将为药物的安全与有效性评价将提供极佳的研究模型。本研究选择慢病毒表达系统,通过构建和筛选抑制P450 3A11表达的miR30-based shRNA的慢病毒载体,并在体外筛选干扰效率最高的重组慢病毒,再通过卵周隙显微注射这一病毒建立P450 3A11基因沉默小鼠,为构建小鼠P450 3A亚家族其它基因的干扰载体并为最终制备CYP3A亚家族人源化小鼠奠定了基础。二、研究内容及结果在第一部分,本课题以慢病毒载体FUW为骨架,构建了表达针对CYP3A11基因基于miR30-shRNA分子的重组慢病毒载体FUW-GFPmiR-shRNA;通过“三质粒包装系统”、利用293FT细胞包装重组慢病毒载体FUW-GFPmiR-shRNA,获得高滴度的重组慢病毒悬液;利用FVBN近交系小鼠的原代培养肝细胞,对构建的重组慢病毒载体的干扰效率进行了检测,初步筛选出具备较高效率的重组慢病毒。结果:1.通过miR-shRNA在线设计软件（http://katahdin.cshl.org:9331/siRNA/RNAi. cgi?type=shRNA）,设计了三个针对位于小鼠CYP3A11保守序列中与人CYP3A亚家族基因序列同源性低的位点的miR-shRNA分子;通过DNA重组,以慢病毒载体FUW为骨架,构建了miR30-based shRNA重组慢病毒表达载体,通过酶切鉴定与测序检测确证了重组的准确性。2.通过“三质粒包装系统”,利用293FT细胞分别包装上述构建的重组慢病毒载体,并通过“二步超速离心法”浓缩病毒悬液,获得了>109的高滴度的重组慢病毒液;分离培养了FVB/N近交系小鼠原代肝细胞,利用浓缩的重组慢病毒液感染肝细胞,通过RT-PCR检测重组慢病毒载体对靶基因的干扰效应。结果表明,相对于未转染组及阴性转染组,FUW-GFP-MiR-shRNA1, 2转染FVB/N小鼠肝细胞后,MiR-shRNA1的抑制效率则可达到（74.9±0.92）%,MiR-shRNA2可抑制（55.3±1.06）% CYP3A11基因mRNA的表达（P<0.05）。在第二部分,开展了通过慢病毒载体介导、结合卵周隙显微注射、以eGFP为报告基因制备CYP3A11基因沉默小鼠、检测小鼠体内CYP3A11基因干扰效率的研究,探讨了通过卵周隙显微注射重组慢病毒研制CYP3A11基因沉默小鼠的效率及小鼠体内基因沉默的效率。结果:1.通过在紫外灯下观察小鼠耳廓皮肤可见eGFP特征性绿色荧光,该结果也表明目的基因已在小鼠体内表达。2.通过检测首建小鼠基因组的DNA,目的基因已经正确整合至转基因小鼠基因组中。3.通过荧光定量PCR分析,显示小鼠的肝脏CYP3A11基因干扰效率为72.7%,表明由慢病毒介导的miRNA分子得以表达并显著地减少目的基因的表达。三、研究结论CYP3A11的miRNA慢病毒载体FUW-GFP-MiR-shRNA构建成功,将其包装成重组慢病毒。通过三质粒慢病毒包装体系,获得了滴度均>1×109TU/ml以上的注射用重组慢病毒。重组慢病毒载体FUW-GFP-MiR-shRNA,尤其是shRNA1,能够显著的抑制小鼠肝细胞CYP3A11基因mRNA的表达。通过慢病毒转基因系统,建立了特异性干扰CYP3A11基因的小鼠,首建小鼠中约有54.7%的个体为阳性。进一步验证了RNAi技术（miRNA）和慢病毒转基因技术结合的在制备基因沉默小鼠模型中的可行性和高效性。