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第一部分新型VWFA2区单克隆抗体的制备及其表位鉴定目的:血管性血友病因子(VWF)是血浆中参与止血过程的重要的蛋白分子,其介导血小板粘附于血管损伤局部达到止血的目的。VWF与血小板的粘附活性直接与其多聚体的分子量大小成正相关,ADAMTS13特异性地切割VWF蛋白A2功能域Y1605-M1606之间的肽键来调节VWF分子量大小。A2功能域VWF73是ADAMTS13最短的保守底物,VWF73肽段从N端开始分别由β4,β5,α4,β6,α5所组成,通过一系列缺失突变技术表明,将α5(R1659-R1668)亚单位从VWF73肽段中剔除导致ADAMTS13几乎无法切割该变异底物,说明α5对于VWF73发挥底物功能起着极其关键作用,是ADAMTS13在VWF73上重要的结合部位。该研究旨在制备抗VWF蛋白A2功能域α5亚单位单克隆抗体,并对其进行抗原表位鉴定,为进一步研究ADAMTS13与VWF相互作用提供新的工具。方法:利用VWFα5-KLH免疫Balb/c雌性小鼠,经标准单克隆抗体技术制备单抗,用ELISA方法鉴定单克隆抗体的特异性及亚型。应用VWFA2功能域多种截短型重组蛋白联合Western Blot法精确定位单克隆抗体的抗原结合表位。结果:最终获得6株抗VWFA2α5的单抗,克隆号分别为5D8、8F1、9D6、9G11、9A11、9C11。其中9G11与血浆源性VWF及VWF蛋白A2功能域α5亚单位均结合,效价均可达50 ng/ml,命名为SZ-179,ELISA法显示其亚型为Ig G1。Western Blot法显示SZ-179与r VWFA2及GST-VWF73-His强反应,而不与r VWFA1及r VWFA3反应,其抗原表位位于VWF蛋白A2功能域的E1660-L1666。结论:SZ-179是一株新型抗VWF蛋白A2功能域的特异性单克隆抗体。为研究ADAMTS13与VWF相互作用机制提供了有力的工具。第二部分SZ-179的功能研究目的:本研究探讨抗VWF蛋白A2功能域α5亚单位单克隆抗体(SZ-179)是否可以通过与VWF的结合而影响ADAMTS13对VWF的水解活性。方法:采用Western Blot法观察SZ-179对rADAMTS13水解GST-VWF73-His的影响,并利用VWF多聚体电泳观察静态/尿素变性条件下SZ-179对血浆中ADAMTS13水解血浆中VWF的影响及其在自然状态下对rADAMTS13水解VWF-R1597W的影响。结果:SZ-179对rADAMTS13水解GST-VWF73-His具有明显抑制作用,并且呈剂量依赖性,50%最大抑制浓度(IC50)为221.8μg/ml。另SZ-179能够剂量依赖性地抑制血浆中ADAMTS13水解血浆中VWF,IC50为0.66μg/ml。同样,SZ-179能够剂量依赖性地抑制自然状态下rADAMTS13水解VWF-R1597W,IC50为13.54μg/ml。结论:SZ-179是一株新型抗VWF蛋白A2功能域的特异性单克隆抗体,它能够剂量依赖性地抑制ADAMTS13对VWF的水解活性,有潜力成为出血性疾病的治疗新策略。