产脂肪酶真菌的分离鉴定、产酶条件优化及酶学性质研究

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脂肪酶是一种酯键水解酶,它可以在油-水界面上催化甘油三酯水解或醇解生成脂肪酸和甘油。脂肪酶在生物能源、食品、医药、洗涤、皮革、造纸等行业领域有广泛的应用。目前国内已有不少的科研工作者对脂肪酶进行了研究。近年来,国内对脂肪酶的需求呈急剧上升的趋势,又由于脂肪酶产量低、种类少和主要依靠进口等缺陷,所以筛选和选育获得高产优势菌株为今后脂肪酶用于工业生产有重要的指导意义。本论文主要从脂肪酶产生菌的筛选鉴定、发酵条件优化、诱变育种、脂肪酶酶学性质等几方面进行了研究,为脂肪酶菌株的育种工作和分子学研究积累资料和提供理论依据。主要研究结果如下:1.从雅安周边采集富含油脂的28份土样中,筛选得到一株产碱性脂肪酶的野生真菌,其脂肪酶酶活力为6.40U/mL。根据菌体的显微形态、生理生化特性及ITS基因序列分析,确定为散囊菌科青霉属的产黄青霉(Penicillium chrysogenum),命名为Penicillium chrysogenum-J23。2.联合单因子实验、正交实验、Plackeet-Burman设计及响应面分析法对P.chrysogenum-J23进行发酵培养基成分和发酵培养条件的优化,确定最佳培养基组成为:蔗糖1.0%,蛋白胨2.0%,橄榄油1.27%,磷酸氢二钾0.75%,黄豆粉2.97%,硫酸镁2.06%,NaH2PO40.1%, Tween800.5%, pH 9.0。最佳摇瓶培养条件为:温度30℃,转速为200 r/min,培养时间为48 h。优化条件后酶活高达13.78 U/mL,与初始菌株相比,产酶量达到优化前的2.21倍。3.以原始菌株P. chrysogenum-J23为出发菌株,进行了紫外(UV)诱变和微波诱变,经过几轮交替诱变处理和筛选,得到了6株在初筛平板上水解圈直径和菌落直径之比(D/d)比出发菌株明显提高的霉菌,进一步测酶活力进行复筛,得到一株产酶量比原始菌株提高53.8%的突变株,经过5次连续的传代测定酶活,其遗传性稳定。4.对P. chrysogenum-J23所产脂肪酶进行酶学性质研究表明:其最适温度为33。C,最适pH为7.5,偏碱性,在pH6.0-10.0酶具有良好的稳定性,在50℃处理2h仍可保持30%以上的酶活力,50mmol/L的Ca2+、Mg2+、K+分别对酶有较强激活作用,而50mmol/L的Fe2+、Mn2+、Cu2+、Pb2+、Li2+对酶则有不同程度的抑制作用。
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