论文部分内容阅读
目的当前临床上针对肿瘤的放射治疗和多数化学药物治疗都是通过损伤肿瘤细胞的DNA达到治疗效果的,不同的因素可导致多种不同类型的DNA损伤,其中双链断裂损伤对肿瘤细胞是最致命的,其主要通过同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)的方式进行修复。肿瘤细胞的DNA修复能力异常活化是造成DNA损伤剂治疗产生耐药的重要因素,因此针对参与DNA修复的分子靶向治疗探索具有重要意义。急性髓系白血病(AML)是一种侵袭性恶性肿瘤,耐药和复发的问题突出,AML细胞和白血病干、祖细胞都可以检测到持续活化或高活性的NF-κB,放射或者DNA损伤化疗药物也可以特异性地激活NF-κB,NF-κB通过调控凋亡和修复相关靶基因的转录,引起放疗抵抗或者化疗药物耐药。聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP1)是一种与DNA修复密切相关的核酶,参与了BER、HR和NHEJ等DNA修复途径,当肿瘤细胞DNA发生损伤时,PARP1可感知DNA损伤并通过PAR化募集相关蛋白,激活NF-κB。长链非编码RNA(lnc RNA)能在表观遗传、转录及转录后水平调控基因表达,广泛参与DNA损伤修复、细胞周期调控等生理或病理过程调控肿瘤的发生发展。本课题层层探讨NF-κB,PARP1,LncRNA-uc002jit.1各分子之间相互调节的具体分子机制,进一步完善NF-κB调节DNA损伤修复理论,寻找清除AML细胞的新靶点、新策略。方法1 NF-κB与PARP1形成正反馈环路调节急性髓系白血病细胞的DNA损伤修复我们通过构建RELA敲减和过表达的AML细胞株验证了RELA对DNA损伤药物柔红霉素(DNR)诱导的AML细胞DNA损伤修复的影响;利用DR-GFP和EJ5-GFP报告质粒分析检测了RELA对AML细胞发生DNA损伤时HR和NHEJ修复通路的影响;通过蛋白免疫印迹检测了RELA对AML细胞DNA损伤时PAR化程度的影响;实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹检测了RELA对PARP1 mRNA及蛋白水平的影响;双荧光素酶报告基因实验验证了RELA对PARP1的靶向转录调控;JASPAR网站预测了RELA与PARP1启动子前2kb的结合位点;染色质免疫共沉淀技术和DNA pull down验证了RELA与PARP1启动子的体内外结合;同时通过构建PARP1敲减的AML细胞株,利用外泌型荧光素酶报告基因验证AML细胞DNA损伤修复时PARP1对NF-κB活性的影响。2 NF-κB与PARP1的双重抑制对柔红霉素在体内外清除AML细胞效力的影响我们用外泌型荧光素酶报告基因检测NF-κB抑制剂BMS-345541和PARP1抑制剂Olaparib联合使用对AML细胞DNA损伤修复时NF-κB活性的影响;用通路特异性的报告质粒和蛋白免疫印迹检测两药联用对AML细胞DNA修复活性的影响;利用流式细胞术,激光共聚焦显微镜,彗星实验检测两药联用对DNR诱导的AML细胞DNA损伤累积的影响;Annexin-V-FITC和PI双染检测两药联用对DNR诱导的AML细胞凋亡的影响;MTT检测两药联用对DNR在体外杀伤AML细胞效力的影响;进而,我们通过构建KG1α细胞异种移植瘤裸鼠模型来检测两药联用对DNR在体内杀伤AML细胞效力的影响。3 RELA/uc002jit.1/PARP1相互调节影响急性髓系白血病细胞DNA损伤修复与细胞增殖我们采用Arraystar人类LncRNA芯片分析了RELA敲减的AML细胞株DNA损伤后LncRNA的差异表达;利用R计算coding与non-coding间的Pearson相关系数,绘制CNC(coding-non-coding)共表达网络构图,寻找跟RELA和PARP1 mRNA共同正相关,且相关系数PCC≥0.98的LncRNA;实时荧光定量PCR检测了RELA对uc002jit.1的影响;双荧光素酶报告基因实验验证了RELA对uc002jit.1的靶向转录调控;JASPAR网站预测了RELA与uc002jit.1启动子前2kb的结合位点;染色质免疫共沉淀技术和DNA pull down验证了RELA与uc002jit.1启动子的体内外结合;接着,我们构建了uc002jit.1敲减的AML细胞株,通过实时荧光定量PCR检测了uc002jit.1对PARP1mRNA及其稳定性的影响,通过蛋白免疫印迹检测了RELA对PARP1蛋白水平及DNA损伤修复时PAR化水平的影响;流式细胞术检测了uc002jit.1对AML细胞DNA损伤修复的影响;利用细胞计数,Ed U染色,集落形成实验测定了uc002jit.1对细胞增殖的影响;利用集落形成实验检测uc002jit.1对DNR的体外增敏作用;通过构建uc002jit.1敲减的AML细胞异种移植瘤小鼠检测了uc002jit.1在体内对AML细胞增殖和DNR增敏作用。结果1 NF-κB与PARP1形成正反馈环路调节急性髓系白血病细胞的DNA损伤修复RELA能够调节AML细胞DNA损伤的HR和NHEJ修复通路,也能通过与PARP1启动子结合,靶向调控PARP1 mRNA的转录,影响AML细胞DNA损伤修复时PAP化水平;同时PARP1也可以影响AML细胞DNA损伤时修复NF-κB的激活,两者形成正反馈调节环路。2 NF-κB与PARP1的双重抑制对柔红霉素在体内外清除AML细胞效力的影响NF-κB和PAPR1的双重抑制能够更加有效地抑制AML细胞DNA损伤的修复,增加DNR诱导的DNA损伤的累积,促进DNR诱导的细胞凋亡和增殖抑制,从而更加显著地抑制AML细胞异种移植肿瘤的生长,延长异种移植瘤裸鼠的生存时间。3 RELA/uc002jit.1/PARP1相互调节影响急性髓系白血病细胞DNA损伤修复与细胞增殖LncRNA芯片显示RELA敲减引起了AML细胞DNA损伤时106个LncRNA发生显著性差异表达,其中78个上调,28个下调,CNC分析得到11个跟RELA和PARP1 mRNA共同正相关,且相关系数PCC≥0.98的LncRNA,其中uc002jit.1下调最为显著。uc002jit.1受到RELA的靶向转录调节,主要分布在细胞质中,通过影响PARP1 mRNA的稳定性和PARP1蛋白的含量,影响AML的DNA损伤修复时PAR化水平,进而影响AML细胞的DNA损伤修复,细胞增殖,以及AML细胞对DNR的体内外敏感性。结论RELA调控PARP1 mRNA以及LncRNA-uc002jit.1的基因转录,转录生成的uc002jit.1又在转录后水平影响PARP1 mRNA的稳定性,三者形成一个正反馈调节环路,从而共同调控DNA损伤修复的多个通路。用药物同时抑制环路中两个重要的分子NF-κB和PARP1,抑制效果就会被环路的正反馈机制放大,从而产生更加显著的作用效果。值得一提的是,我们发现了一个全新的LncRNA-uc002jit.1,其具有影响AML细胞DNA损伤修复,细胞增殖和增敏化疗药物体内外作用的显著生物学功能。本研究为AML治疗提供了新靶标,也为AML使用DNA损伤化疗药物治疗的预后提供了新的生物标志物,同时为PARP1抑制剂用于AML患者提供了新的理论依据,拓宽了PARP1抑制剂适用人群。