本论文基于CD133/Prominin1基因启动子活性在肿瘤细胞之间的差异，以胶质瘤细胞株U251为研究对象，通过该基因启动子调控新霉素抗性基因与单纯疱疹病毒胸苷激酶基因在细胞内的特异表达，分别分选出具有CD133基因启动子活性的U251细胞即pCD133（+）U251细胞与不具有CD133基因启动子活性的U251细胞即pCD133（-）U251细胞。通过比较两种细胞表面CD133的表达以及相关生物学功能差异，探讨应用CD133启动子活性在细胞群体的差异是否能够有效进行肿瘤干细胞的分离，从而提出一种新的肿瘤干细胞分选方法。通过本研究取得如下研究结果：1.阐明了CD133基因启动子活性在胶质瘤细胞株U251存在差异性。应用构建的CD133启动子调控绿色荧光蛋白基因表达的慢病毒载体包装颗粒感染胶质瘤细胞株U251，观察到绿色荧光蛋白只在部分的U251细胞内表达，说明CD133启动子只在少部分的U251细胞内具有活性。为通过启动子活性差异进行肿瘤干细胞的分选奠定理论基础。2.成功从U251群体细胞中筛选出具有CD133基因启动子的pCD133（+）U251细胞。应用CD133基因启动子调控新霉素抗性基因表达的慢病毒载体包装颗粒感染胶质瘤细胞株U251，通过G418筛选，能够启动新霉素抗性基因表达的具有CD133启动子活性的U251细胞存活，而不能启动新霉素抗性基因表达的不具有CD133启动子活性的U251细胞被药物杀死，从而筛选出pCD133（+）U251细胞。筛选出的U251细胞在G418存在的情况下，能够继续生长与传代。3.成功从U251群体细胞中筛选出不具有CD133基因启动子活性的pCD133（-）U251细胞。应用CD133基因启动子调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因表达的慢病毒载体包装颗粒感染胶质瘤细胞株U251，通过潮霉素筛选出基因稳定转染的细胞株后，通过给予前体药物丙氧鸟苷，杀死能够启动单纯疱疹病毒胸苷激酶基因表达的具有CD133启动子活性的U251细胞，而不能启动单纯疱疹病毒胸苷激酶基因表达的不具有CD133启动子活性的U251细胞得以存活，从而筛选出pCD133（-）U251细胞。4.阐述了pCD133（+）U251细胞含有少部分CD133(-)的细胞群体。通过细胞免疫化学染色方法以及流式细胞术分别检测CD133基因启动子活性阳性与阴性两种细胞的细胞表面CD133蛋白的表达，结果显示pCD133（+）U251细胞包括细胞表面标志为CD133(+)的细胞占80%左右，CD133(-)的细胞占20%左右。而pCD133（-）U251细胞没有检测到CD133(+)细胞，全部为CD133(-)细胞。说明本研究方法不能有效的完全分离出pCD133(+)细胞，但可有效分离出pCD133(-)细胞。5.阐述了两种细胞在细胞增殖方面具有差异性。通过对两种细胞生长曲线检测以及细胞周期的测定，结果显示pCD133（+）U251细胞在正常血清培养基中增殖能力明显高于pCD133（-）U251细胞，并能够连续传代，传5代以上的细胞仍保持旺盛的增殖能力，而pCD133（-）U251细胞传代3次以后，基本停止生长。体外软琼脂克隆实验结果显示pCD133（+）U251细胞具有良好的克隆生成能力，为65%左右，而pCD133（-）U251不具有克隆形成能力。6.阐述了pCD133（+）U251细胞可以转变为pCD133（-）U251细胞，而pCD133（-）U251细胞不能转变为pCD133（+）U251细胞。应用流式细胞术检测pCD133（+）U251细胞在无G418存在情况下，pCD133（-）U251细胞无GCV存在情况下第1天，第6天，第12天的细胞表面表达CD133蛋白细胞的数目变化，结果显示pCD133（+）U251细胞表面表达CD133蛋白细胞数目的比例随培养时间逐渐下降，而pCD133（-）U251细胞表面表达CD133蛋白细胞数目无变化。说明pCD133（+）U251细胞在无药物压力的情况下，在血清培养的环境中，随细胞数目的增多细胞表面表达CD133的细胞逐渐分化成CD133（-）U251细胞。应用CD133启动子调控绿色荧光蛋白基因表达的慢病毒载体包装颗粒分别感染pCD133（+）U251细胞与pCD133（-）U251细胞，应用流式细胞术检测感染后第1天，第6天，第12天细胞绿色荧光蛋白表达的情况，结果表明，pCD133（+）U251细胞表达绿色荧光蛋白的细胞数目随时间的改变逐渐减少，而pCD133（-）U251细胞表达绿色荧光蛋白的细胞数目随时间无改变。说明pCD133（+）U251细胞在无药物压力的情况下，在血清培养的环境中，随细胞培养时间CD133启动子活性逐渐丢失。通过上述研究成果，本论文首次阐述了应用CD133启动子活性在细胞群体的差异能够有效进行肿瘤干细胞的分离，从中获得的科学研究意义在于：1.通过本研究技术方法可以成功分离出完全的细胞表面标志为CD133(-)的细胞。不具有CD133启动子活性的细胞就不能进行CD133基因的转录并进一步翻译成CD133蛋白，从而保证了筛选出的CD133(-)的细胞为完全的CD133(-)的细胞，避免应用CD133抗体进行分选由于受到蛋白抗原表位差异产生的分选假阴性，即CD133(-)的细胞内含有CD133(+)的细胞。通过对完全的CD133(-)生物学活性研究结果也证实了只有CD133(+)细胞才具有肿瘤干细胞的特性。2.进一步证实了CD133基因的转录活性与CD133表面标志检测的不一致性。多数文献研究显示细胞表面表达CD133的U251胶质瘤一般占群体细胞的2%-5%左右，本研究流式细胞数测定结果在5%左右，具有CD133启动子活性细胞占15%左右，明显高于可检测到的细胞表面表达CD133蛋白的细胞。流式细胞术检测筛选的pCD133（+）U251细胞中细胞表面CD133表达的比例，结果显示细胞表面CD133表达的细胞比例占81%左右，并不是全部细胞。说明了CD133基因的转录活性与CD133表面标志检测结果是不一致的。3.通过本研究的技术手段可以使分离的肿瘤干细胞在贴壁培养的条件下得以扩增。在多数文献报道中，胶质瘤干细胞包括其他肿瘤干细胞常用的扩增方法是悬浮无血清培养法。而本研究采用的在抗性药物的筛选下，可以在有血清贴壁情况下有效进行pCD133(+)细胞的扩增。4.本研究的研究结果提示靶向杀伤肿瘤干细胞以具有CD133启动子活性的肿瘤干细胞为目标优于以细胞表面CD133蛋白为靶点的治疗方法。具有CD133启动子活性的肿瘤细胞包括了pCD133（+）细胞与pCD133（-）细胞，肿瘤靶向治疗时可以完全靶向CD133（+）细胞。而以细胞表面CD133蛋白为靶点，由于蛋白的变异，使某些靶向药物很难完全清除掉CD133表达的细胞，从而影响治疗的效果。5.本研究技术与理论可以扩展到其他以CD133为分选标志的肿瘤干细胞的分离，但应考虑CD133多个启动子在不同组织启动子基因表达的特异性，应根据肿瘤细胞的种类采用不同的启动子进行肿瘤干细胞分离。本研究虽然在体外细胞水平证明了通过CD133启动子活性在细胞个体的不同进行有效的肿瘤干细胞分离,但需要进一步在动物体内验证分离细胞的肿瘤生成能力，同时对于感染自杀基因的细胞接种于肿瘤细胞，成瘤后，给予前体药物，在体内杀伤CD133细胞后，观察肿瘤消退情况，从而进一步明确体内靶向清除CD133(+)细胞是否能够有效抑制肿瘤的生长与转移。从而进一步完善肿瘤干细胞理论基础。