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研究背景MAGE-A1基因(Melanoma Associated Antigen Family A1)是一种癌症生殖(cancer-germline,CG)基因或者肿瘤睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)基因,染色质定位于人类X染色体q28区域,近年来发现MAGE-A1基因在多种肿瘤中,包括黑素瘤中表达增高。本研究通过之前研究发现,从色素痣、原位黑素瘤到转移黑素瘤MAGE-A1基因表达逐步增高。miRNA是存在真核生物体内的内源性小分子RNA,长度约22bp左右,miRNA通过与靶基因结合形成二聚体,可导致靶基因的降解或者抑制其翻译,达到调节基因表达的目的。近年来的研究发现在黑素瘤EMT过程中,多个重要调节基因可以被多个miRNA调控。本研究结合mRNA转录组和niRNA组数据,分析对黑素瘤EMT过程有重要调控作用的miRNA。目的1.确定MAGE-A1基因在黑素瘤恶化和转移过程中的作用,研究其分子调控机制。2.筛选出对黑素瘤EMT过程有重要调控作用的miRNA,验证其细胞生物学功能和参与的调控网络。方法一、MAGE-A1基因过表达及敲低对黑素瘤细胞功能的影响及其作用机制分析1.qRT-PCR检测细胞系及黑素瘤患者样本中MAGE-A1基因的表达。2.在A375,A2058细胞构建过表达和敲低MAGE-A1基因细胞系。3.应用克隆形成,细胞增殖和细胞周期实验观察过表达和敲低MAGE-A1基因对黑素瘤细胞增殖能力的影响。4.Transwell小室实验观察过表达和敲低MAGE-A1基因对黑素瘤细胞侵袭和迁移能力的影响。5.通过RNA-seq转录组测序研究A375细胞中过表达和敲低MAGE-A1基因对细胞基因表达的影响,运用GO和IPA等生物信息学软件分析其影响的细胞功能并构建相应的调控网络。二、miRNA调控黑素瘤EMT过程的分子网络及其调控机制1.结合nRNA转录组和miRNA组数据,应用生物信息学方法筛选对黑素瘤EMT过程有调控作用的miRNA。2.qRT-PCR检测细胞系中miRNA的真实表达情况。3.通过transwell小室实验观察A375细胞过表达miRNA寸黑素瘤迁移能力的影响。4.运用IPA等软件分析在黑素瘤EMT过程中miRNA靶基因参与的细胞功能和调控网络。5.qRT-PCR分析过表达miRNA细胞系中EMT相关关键基因的表达变化。结果一、MAGE-A1基因过表达及敲低对黑素瘤细胞功能的影响及其作用机制分析1.相比色素痣,黑素瘤细胞系和患者组织样本中MAGE-A1基因的表达水平升高,两者之间差异有统计学意义(P<0.05)。2.在黑素瘤A375和A2058细胞系,过表达MAGE-A1基因能明显增强黑素瘤的克隆形成和细胞增值能力，反之敲低MAGE-A1基因导致下降,细胞周期测定与上述结果一致(P<0.05)。3..黑素瘤中过表达MAGE-A1基因,其侵袭和迁移能力增强,而敲低则导致降低(P<0.05)。4.RNA-seq分析发现，MAGE-A1基因通过对MAPK-ERK, PI3K-AKT, NF-κB, Hedgehog和Wnt信号通路的调控影响黑素瘤的EMT过程。二、miRNA调控黑素瘤EMT过程的分子网络及其调控机制1.通过Mirbase等软件预测出11个miRNA和48个对应的靶基因。2.在3个细胞系中，经过qRT-PCR验证发现7个miRNA与预测的结果一致。3.黑素瘤细胞迁移实验发现除miR-195-5p卜,其它6个miRNA过表达对黑素瘤的迁移能力有明显的影响。4.在7个过表达miRNA细胞系,对EMT相关重要基因进行mRNA水平验证发现nir-195-5p, mir-130a-3p, mir-509-5p和mir-509-3-5p这4个miRNA对黑素瘤EMT过程具有重要影响。5.通过11个miRNA对应的48个靶基因构建分子调节通路发现，11个miRNA参与了多个肿瘤EMT相关的通路调节。结论1 MAGE-A1基因通过MAPK-ERK、PI3K-AKT、NF-κB、Hedgehog和Wnt等多个信号通路参与黑素瘤的EMT过程,并对黑素瘤细胞的克隆形成,细胞增殖和侵袭迁移能力产生影响。2.生物信息学研究发现11个miRNA通过干预Wnt、VEGF、NF-κB、PTEN、 PI3K-AKT等信号通路途径：以及对TP53、c-MYC和MMP9等重要基因的促进或者抑制作用,调控黑素瘤的EMT过程。通过体外transwell小室等生物学实验证实,其中6个miRNA对黑素瘤细胞迁移能力的改变具有统计学差异。qRT-PCR分析得出4个miRNA对黑素瘤EMT过程中重要基因表达有影响。