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背景乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤之一,其中雌激素受体阳性的乳腺癌占所有乳腺癌类型的2/3。除外科手术外,雌激素受体阳性乳腺癌病人给予内分泌治疗药(他莫昔芬)疗效显著。但是通过大量的临床数据显示,雌激素受体阳性病人长期使用内分泌治疗药物(他莫昔芬)发生耐药现象,而耐药的机制可能是与雌激素信号通路失调有关。之前的研究报道雌激素受体翻译后修饰与内分泌耐药显著相关,因此迫切寻找新的药物靶点。TRIM56(Tripartite motif containing 56)蛋白作为一种泛素相关蛋白,在之前的报道中该蛋白在影响细胞周期、抗病毒、肿瘤的发生中等扮演重要的作用,但是该蛋白在乳腺癌中的功能尚不明确,因此进一步明确TRIM56在乳腺癌的发病机制中的功能具有重要的意义及作用。目的探讨TRIM56蛋白调控雌激素信号通路及他莫昔芬耐药的机制研究,并为后续开发新一代内分泌治疗药物提供新思路和方法。方法1、通过搜集临床样本及查询TCGA、Kmplot数据库,明确TRIM56在人乳腺癌病人的组织中表达。2、通过裸鼠成瘤实验验证TRIM56是否影响裸鼠体内移植瘤的生长。3、运用细胞增殖实验、细胞划痕实验及克隆形成实验,明确TRIM56对雌激素受体阳性乳腺癌的细胞增殖、及细胞迁移的影响。4、在ERα阳性的乳腺癌细胞系中,利用全基因组总RNA测序结果分析,验证TRIM56是否能够调节雌激素信号通路。5、通过qRT-PCR及Western blot检测TRIM56在乳腺癌细胞系转染的沉默效果及明确TRIM56对雌激素信号通路中靶基因的影响。在此基础上观察雌二醇作用下,用qRT-PCR检测TRIM56对ERα下游基因的影响受雌二醇的调节,利用荧光素酶报告基因技术检测TRIM56是否影响ERα转录活性。6、通过核浆分离实验和免疫荧光实验明确TRIM56和ERα的细胞定位,通过免疫共沉淀实验验证TRIM56和ERα是否具有相互作用。为进一步验证TRIM56和ERα的具体结合区域,同时构建了TRIM56和ERα蛋白各自不同的结构域。7、运用Western blot实验技术,通过MG132实验、Co-IP、CHX实验以及泛素化实验验证TRIM56调节ERα蛋白的稳定性。结果1、通过搜集乳腺癌样本病理标本及查询TCGA、Kmplot数据库,发现TRIM56在雌激素受体阳性的乳腺癌病人组织标本中与癌旁组织相比表达量有明显差异,且TRIM56表达量与病人的预后呈负相关。2、通过在裸鼠乳腺脂肪垫内原位种植shTRIM56的MCF-7病毒稳转株。28天后和shControl组相比发现,shTRIM56组的小鼠体内移植瘤生长速度缓慢,并且重量轻、体积小。3、通过细胞增殖实验、细胞划痕实验及克隆形成实验,发现沉默TRIM56可以减弱乳腺癌细胞的增殖能力以及细胞迁移能力。4、在ERα阳性的乳腺癌细胞系通过运用全基因组RNA测序结果分析显示,沉默TRIM56能够明显抑制雌激素信号通路下游基因的表达水平。5、利用ERα阳性的乳腺癌细胞株,通过运用qRT-PCR和Western blot验证TRIM56的沉默效果,并发现沉默TRIM56使雌激素信号通路中几个经典的靶基因下调非常明显,而当沉默TRIM56可使ERα的蛋白水平明显下调。而且在此基础之上加入雌二醇,利用同样的方法发现在雌二醇作用下会导致雌激素信号通路能够被再次激活。通过荧光素酶报告基因实验证明沉默TRIM56能够显著抑制ERα的转录活性。6、通过核浆分离实验及免疫荧光实验发现TRIM56主要定位在细胞浆,并且通过Co-IP、GST-pull down实验发现TRIM56和ERα具有相互作用,且两者的结合是在胞浆中进行。为进一步验证两者的相互作用具体结合部位,通过分别构建两者的结构域(Domain),然后通过免疫共沉淀实验验证两者的结合部位分别是在TRIM56的WD40段和ERα的AF1段结合。7、通过CHX实验发现沉默TRIM56能够缩短ERα的半衰期,此外过表达TRIM56能够延长ERα的半衰期,通过MG132实验及Co-IP实验,借助K48、K63等泛素化质粒,进一步证明了TRIM56能够抑制ERα的K48多聚泛素化能够增强ERα的K63泛素化,最终导致ERα蛋白的稳定。结论通过数据库、临床病理标本发现TRIM56与ERα阳性乳腺癌差的预后以及内分泌治疗耐药具有相关性。通过分子生物学水平发现TRIM56是调节雌激素信号通路的重要蛋白。并且E3泛素连接酶TRIM56通过K48和K63连接的泛素化蛋白酶体途径调节ERα蛋白的稳定性。