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近几年大规模牛场犊牛化脓性肺炎发病率呈上升趋势,经检测其病原以化脓性隐秘杆菌(A. pyogenes)为主。本研究旨在建立快速检测A.pyogenes的PCR诊断方法,并表达部分PLO蛋白,将其作为抗原,初步建立间接ELISA检测方法。本研究将来源于不同地区的病料,经细菌分离和生化试验初步鉴定为Arcanobacterium,设计4对引物,第一对为16S rRNA通用引物用来扩增A.pyogenes16S rRNA,对分离株进行同源性比较并构建系统进化树;第二对为针对A. pyogenes 16S rRNA设计的特异性引物用来扩增特异性目的基因,建立PCR诊断方法;第三对为扩增PLO全基因引物,分析牛源PLO与GenBank公布的猪源PLO的同源性;第四对针对PLO的生物活性区域设计引物,扩增部分PLO,构建表达载体pQE30-PLO,通过Western Blotting和协同溶血试验(CAMP)检测蛋白生物学活性,并用该蛋白作为抗原,建立间接ELISA检测方法。从不同地区患有化脓性肺炎的犊牛体内分离到6株菌株,扩增16S rRNA得到1490~1492bp的目的基因,经Blast分析证实分离菌株是A. pyogenes。6株分离株之间同源性在99.7 %~100%。经系统进化分析,6株分离株均为A. pyogenes。特异性引物扩增目的基因大小为927bp,特异性试验结果表明6株分离株均能扩增出927 bp的目的基因,而其他细菌扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,PCR最低检出量为42个A. pyogenes。扩增牛源PLO大小为1649bp,与GenBank公布的猪源PLO同源性为97.5%。A. pyogenes PLO生物活性区域扩增目的基因大小为585bp,重组蛋白经SDS-PAGE分析,可以在XL1-blue宿主菌中表达,蛋白大小为27.45 kDa。经Western Blotting检测,重组蛋白具有良好的反应原性,用溶血试验检测,重组蛋白具有溶血活性。用建立的间接ELISA检测方法检测以化脓为主的P.multocida、E.coli、S.aureus及S. pneumoniae等四种细菌抗血清,均未发现交叉反应,表明特异性良好,对临床样本进行检测,符合率为86.67%。本研究成功建立了A. pyogenes PCR诊断方法,为A. pyogenes引起的牛化脓性肺炎的快速诊断及流行病学调查提供了新的手段。同时初步构建了A. pyogenes重组原核表达载体pQE30-PLO585,以该重组蛋白作为包被抗原初步建立了间接ELISA检测方法,为进一步完善A. pyogenes临床监测方法提供了新手段,为疫苗的开发研究奠定了基础。