棉花（Gossypium spp.）作为全球最重要的经济作物之一,也是世界上重要的天然纤维和油料的来源之一,但是其产量以及纤维品质极严重的受到黄萎病菌（Verticillium dahliae）的危害而显著降低。在我国,棉花每年因黄萎病菌感染而造成的经济损失超过几十亿元,因此棉花黄萎病菌的防治非常急迫。迄今为止,黄萎病菌入侵棉花的过程与致病机理依然不清楚,所以研究棉花中的主要抗病相关基因的作用机制,深入探究并发掘黄萎病菌中的致病关键基因,不仅为研究棉花与黄萎病菌互作机理提供理论依据,而且为创制棉花抗病种质材料提供重要的候选基因。本研究分别用抗病性较好的海岛棉Hai7124、感病品种军棉1号,以及黄萎病菌生理型V991和Vd8为实验材料,系统地探究及功能解析了棉花中几丁质相关的抗病基因和黄萎病菌中关键的致病基因。主要研究结果如下:1.植物中的先天性免疫反应（PTI）的激活主要通过植物的模式分子识别受体（PRR）成功地感知病原菌相关的模式分子（Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）,而几丁质受体蛋白作为植物中最典型的模式识别受体之一,感应植物真菌病原菌激活免疫反应。我们分别从二倍体雷蒙德氏棉和亚洲棉,四倍体陆地棉TM-1和海岛棉3-79中对棉花几丁质受体蛋白进行系统地鉴定和功能分析。分别在雷蒙德氏棉、亚洲棉、TM-1和海岛棉3-79中鉴定出29,30,60和56个几丁质受体蛋白。以雷蒙德氏棉为例,按照进化分析与基因结构特点可以把几丁质受体蛋白分成4类,分别为Lyk、Lyp、LysMe和LysMn。为了进一步阐述基因的功能,我们分别在TM-1的不同组织和器官中、以及几丁质和几丁质片段6氮乙酰壳六糖、不同胁迫信号分子和黄萎病菌诱导下,分析基因的表达特征。结果发现3个几丁质受体蛋白基因,Lyp1、Lyk7和LysMe3显著地受到几丁质信号,不同胁迫信号以及黄萎病菌的诱导,而且表达水平明显高于其他基因。亚细胞定位分析表明Lypl、Lyk7和LysMe3是典型的膜绑定蛋白,暗示Lyp1、Lyk7和LysMe3可能参与几丁质的识别和防御反应的激活。为了进一步探究Lyp1、Lyk7和LysMe3在棉花防御黄萎病菌中的作用,利用病毒诱导基因沉默VIGS（virus-induced gene silencing）技术在抗病材料Hai7124中分别沉鴃Lyp1、Lyk7和LysMe3,发现沉默上述基因后棉花抗病能力明显地受到抑制。进一步研究发现,沉默这三个基因后,导致水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和活性氧（ROS）合成通路的关键基因其表达水平显著下调。而某些相应的PR基因的表达水平也明显受到了抑制。这些结果表明,Lyp1、Lyk7和LysMe3可能是棉花中特异的植物细胞表面的模式识别受体（PRR）,参与识别几丁质信号以及激活下游的PR基因,诱导棉花对黄萎病菌的防御。2.几丁质酶作为棉花中公认的抗病相关PR基因,通过降解真菌细胞壁中几丁质,释放小分子几丁寡糖,从而抑制真菌的正常生长。本研究分别在二倍体测序棉种雷蒙德氏棉与亚洲棉,四倍体陆地棉TM-1以及海岛棉3-79中对棉花中几丁质酶家族成员进行鉴定和功能分析。结果发现,雷蒙德氏棉、亚洲棉、陆地棉TM-1以及海岛棉3-79中分别鉴定出47、49、92和116个几丁质酶基因。相似性分析结果表明,二倍体与四倍体棉花之间的几丁质酶同源基因的数目并非是一一对应关系,表明不同棉种在进化过程中可能会存在差异。以二倍体雷蒙德氏棉为例,按照基因在染色体上的分布位置顺序依次命名为GrChi1-47,并通过序列相似性对其他棉种的几丁质酶基因命名。同时,根据系统进化与基因结构的特点,把来源于雷蒙德氏棉的47个几丁质酶基因分成6类,依次命名为A-F组。经过对转录组中FPKM>1的筛选原则,我们在陆地棉TM-1的不同组织和器官中分析了 59个几丁质酶基因的表达特征,发现这些基因在各种组织的不同发育和生长时期的呈现多样性表达特征。为了进一步分析棉花几丁质酶基因在黄萎病防御过程中的功能机理,我们选择23个在棉花根中表达水平相对较高的几丁质酶基因,探究其在黄萎病菌处理的Hai7124根中的表达特点。结果发现,8 个棉花几丁质酶基因,Chi2、Chi14、Chi17、Chi23、Chi25、Chi28、Chi32 和 Chi47显著地受到了黄萎病菌的诱导,暗示这些基因可能参与棉花对黄萎病菌的防御过程。另外,我们选择具有不同诱导表达水平的Chi23、Chi32和Chi47基因分别构建了 VIGS载体,沉默这3个基因的转录水平后,接种黄萎病菌后观察VIGS及对照植株的抗病表型。结果发现,相对于对照,降低Chi32和Chi47的表达水平后,显著地抑制了棉花对黄萎病菌的抗病性。表明Chi32和Chi47是棉花中重要的PR基因,在棉花对黄萎病菌的免疫反应中发挥重要作用。3.G蛋白（异鸟嘌呤核苷酸结合蛋白）信号作为真菌生物中最重要的信号通路之一,通过感知外界信号将其整合为内在信号转导途径。在真菌中,G蛋白调控着营养生长和致病性等多种多样的细胞功能,包括抱子的产生、菌落的形态、侵染结构的差异性和致病性。RGS（Regulator of G protein signaling）是G蛋白α亚基的负调控因子,作为GTPase加速器,主要参与促进GTP的水解,然后负调控G蛋白,并且迅速关闭G蛋白偶联信号转导通路。本研究在强致病力落叶型菌株Vd8中分别克隆了 8个VdRGS 基因,依次命名为 VdRGS1、VdRGS2、VdRGS3、VdRGS4、VdRGS5、VdRGS6、VdRGS7和VdRGS8。与公布的测序菌株VdLs.17中相似性最高的基因依次为VDAG₀0683,VDAG₁0098、VDAG₀0979、VDAG₀2225、VDAG 09977、VDAG₀2523、VDAG₀8194和VDAG₀7045。在棉花根诱导的黄萎病菌中分析了8个RGS基因的表达特征,发现VdRGS1极显著的受到寄主棉花的诱导,处理24小时后,表达水平相对于对照,明显增加近20倍,而且表达水平也显著高于其他RGS基因,暗示VdRGS1可能参与黄萎病菌的致病性。为了进一步探究VdRGS1的功能,根据遗传学上同源置换的原理,利用以农杆菌介导的遗传转化方法（Agrobacterium tumefaciens mediated transformation,ATMT）,获得VdRGS1基因缺失和互补突变体（△VdRGS1;VdRGS1-com）。表型分析结果显示,与野生型Vd8和VdRGS1互补突变体相比,△VVdRGS1出现微菌核丧失、菌丝异常、孢子产量受到抑制以及致病力丧失等表型。另外,基于宿主诱导基因沉默的技术,我们构建了 TRV:GFP载体,注射棉花,通过观察入侵的V991-GFP菌株中孢子的GFP荧光信号,进一步验证了烟草脆裂病毒（TRV）介导的病毒诱导基因沉默（VIGS）在棉花中沉默入侵黄萎病菌的基因的可行性。分别在不同生理型黄萎病菌Vd8和V991中克隆VdRGS1,发现两个菌株中该基因序列完全相同。选择该基因的4个不同区段分别构建 TRV:VdRGS1-1、TRV VdRGS1-2、TRV:VdRGS1-3和 TRV:VdRGS1-4四个载体,利用VIGS沉默入侵黄萎病菌Vd8和V991中VdRGS1基因。结果发现,VIGS幼苗接种Vd8后,注射TRV:VdRGS1-2和TRV:VdRGS1-5的幼苗中入侵的Vd8菌株中VdRGS1基因被沉默,导致接种25天的幼苗的病叶率仅55%,而未注射的和其他VIGS幼苗发病率高达95%。劈杆后观察维管束表型发现,相对于对照,注射TRV:VdRGS1-2和TRV:VdRGS1-3的幼苗茎秆中的黑色素及微菌核的积累的量极少。同样,接种V991后,发现注射TRV:VdRGS1-1和TRV VdRGS1-4的幼苗中入侵V991菌株中VdRGS1基因被沉默,接种25天的幼苗病叶率约60%,而未注射的和其他VIGS幼苗的病叶率约100%。这些结果表明,VdRGS1调控微菌核的形成、菌丝发育、孢子产量以及致病力等,这些特点也正是黄萎病菌的防治难点。利用VIGS技术沉默入侵的Vd8和V991中靶基因VdRGS1可有效地提高棉花对黄萎病菌的广谱抗性。因此,HIGS技术沉默入侵病原菌关键基因,结合植物中过量表达抗性基因或抑制感病基因,可以更加有效的增加提高棉花对黄萎病菌抗性。