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研究背景药物性肝损伤（drug-induced liver injury,DILI）正越来越成为影响公众健康和药物开发的严重问题。临床前药物安全性评估旨在最大限度地避免对人体健康的潜在风险,同时降低药物研发成本。然而,由于存在种属差异,常规的临床前动物安全性评价实验与人体DILI存在较差的相关性。基于人源性细胞的体外肝毒性预测系统的发展,有助于解决动物实验带来的种属差异问题,并且体外试验周期短,能够实现高通量检测,并能探究药物致肝毒性的机制信息。但使用任何单一的检测终点已被证实均无法准确预测人体DILI,因此,以细胞为基础的体外多参数组合预测人体DILI,成为新药开发早期肝毒性筛选的研究趋势。有研究表明,以ROS/ATP的比值作为终点用于检测药物的肝毒性,结果具有很高的敏感性和特异性。与传统的单一终点评价药物毒性相比,这种复合型终点考虑了药物的多机制毒性作用,提高了预测的准确性;与现有的多终点组合预测系统相比,比值型终点简化了实验程序,有助于体外肝毒性的标准化预测,这对于新药开发早期候选化合物的大规模筛选具有重要意义。因此,这种复合比值型终点为体外肝毒性的标准化预测提供了新思路,具有较高的研究价值。研究目的本研究旨在通过以体外肝毒性筛选最常用的HepG2细胞和人源化程度更高的人诱导多功能干细胞（human induced pluripotent stem cells,hiPSCs）分化的肝细胞为模型,对终点ROS/ATP识别肝毒性的敏感性和特异性进行验证,从而进一步确证ROS/ATP作为体外肝毒性检测终点的可行性。研究方法与结果本研究分为四个部分。第一部分:8种候选药物对HepG2细胞活力的影响本部分研究以HepG2细胞为模型,选取8种临床上具有不同程度肝毒性的药物用于检测,以临床治疗剂量下最大血浆药物浓度Cmax的100倍(100×Cmax)作为每个药物的最大检测浓度,其余浓度为50×Cmax、25×Cmax、12.5×Cmax及6.25×Cmax。药物作用于细胞24 h后,通过细胞增殖-毒性检测试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）检测对HepG2细胞存活率的影响,以确定候选药物用于后续多参数检测实验的浓度。结果表明,对于严重肝毒性药物盐酸胺碘酮、苯溴马隆、丙戊酸钠和盐酸特比萘芬,在100×Cmax浓度范围内均表现出毒性,IC50/Cmax的比值均小于100;对于无肝毒性药物地塞米松,在100×Cmax浓度范围内与对照组相比无显著变化,IC50/Cmax值远远大于100;对于3种中度肝毒性药物细胞活力检测结果的预测性较差,盐酸氯丙嗪的毒性较为明显,而西咪替丁和卡托普利未表现出明显毒性。初步确定了以100×Cmax作为候选药物最大浓度用于后续多参数检测的可行性。第二部分:基于HepG2细胞的多参数肝毒性检测系统的建立本部分实验以HepG2细胞为模型,检测阳性药物盐酸胺碘酮对HepG2细胞多个终点的影响。盐酸胺碘酮按照第一部分的方法设5个浓度,药物处理细胞24 h后,用荧光酶标仪检测细胞内ROS的激活、ATP含量、半胱天冬酶3/7（caspase3/7）的激活以及还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）含量的影响,ROS用细胞活力值进行校正。结果表明,用细胞活力校正后的ROS检测结果的准确性显著提高,变化的趋势更接近流式细胞仪检测结果,且比流式细胞仪检测的灵敏性更高。四个检测终点均产生了不同程度的变化,并呈剂量依赖性。确定了各参数的检测条件及最佳检测方法,为后续该检测系统用于体外肝毒性筛选建立了标准。第三部分:基于HepG2细胞的多参数检测系统用于肝毒性筛选本部分研究以HepG2细胞为模型,选取27种在临床上具有不同程度肝毒性（严重肝毒性,中度肝毒性,无肝毒性）的药物,依据第二部分的检测条件和步骤检测27种药物对HepG2细胞ROS、ATP、caspase3/7（简称caspase）以及GSH含量的影响,用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,简称ROC曲线）法对单一的终点ROS、ATP、caspase、GSH以及复合比值型终点ROS/ATP、caspase/ATP、GSH/ATP预测肝毒性的准确性进行统计,得到ROC曲线下面积用于确定不同浓度下各终点识别不同程度肝毒性药物的性能。结果表明,与其他终点相比,复合型终点ROS/ATP区分肝毒性药物和非肝毒性药物的性能最好,在25×Cmax、50×Cmax以及100×Cmax浓度下均有最好的ROC曲线下面积:分别为0.9342、0.8816、0.9485,在100×Cmax浓度时具有最好的敏感性和特异性,分别为82.35%和100%。此外,ROS/ATP区分严重肝毒性药物和非严重肝毒性药物同样有很好的性能,在25×Cmax、50×Cmax以及100×Cmax浓度下ROC曲线下面积分别为0.8580、0.8239、0.8867,在100×Cmax浓度时具有最好的敏感性和特异性,分别为100%和73.33%。第四部分:ROS/ATP的比值在hiPSCs分化的肝细胞的肝毒性检测中的应用根据前期的研究结果,本部分实验以两种不同来源的hiPSCs分化的肝细胞（hiPSC-derived hepatocyte-like cells,hiPSC-HLCs）为模型,对6个具有肝毒性的药物的ROS、ATP含量进行检测,以验证复合型检测终点ROS/ATP在不同的细胞模型中的预测性能。根据ROS/ATP的检测结果对4种肝毒性药物进行排序,结果表明两种hiPSC-HLCs模型的排序结果与4种药物在临床上引起的肝毒性程度排序结果相一致,即盐酸胺碘酮>丙戊酸钠>吡嗪酰胺>卡托普利。与单一终点ROS、ATP相比,ROS/ATP在三种细胞模型中区分不同程度肝毒性药物的性能均最好;相比于HepG2细胞,两种hiPSC-HLCs的ROS/ATP结果之间的差异性更小,且两种hiPSC-HLCs暴露于药物后的ROS/ATP含量升高的幅度更大。研究结论1.以HepG2细胞为模型,在25-100×Cmax浓度下检测药物对细胞ROS/ATP的比值的影响,有助于区分具有不同程度肝毒性的药物。2.以hiPSC-HLCs为模型,在25-100×Cmax浓度下检测ROS/ATP有助对临床上具有不同程度肝毒性的药物进行排序。3.相比于HepG2细胞,hiPSC-HLCs的ROS/ATP检测终点的灵敏性更高,且可能有助于识别临床上造成非肝细胞损伤型的肝毒性药物。