研究背景缺氧缺血性脑病（Hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）是新生儿期常见的疾病,是导致新生儿死亡和远期神经系统发育障碍的重要因素。由于其发病机制尚不明确,对其损伤后的治疗仍无有力措施。探讨发病机制并在其关键分子上进行有效干预,对于改善HIE预后,提高人口质量具有重要意义。托吡酯（topiramate,TPM）,是一种高效新型抗癫痫药,大量实验表明其在脑损伤后脑保护中发挥着重要作用。越来越多的研究表明托吡酯在保护缺氧缺血性脑损伤（Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）发挥着重要的作用,未来有可能用于临床治疗HIBD。但是关于托吡酯脑保护作用的具体机制、给药剂量及药物副作用等目前研究较少。胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF）是TGF-β超家族的一个新亚族成员,发挥着多效能的神经营养作用,并且在改善和促进损伤后的神经元修复和再生中发挥着重要作用。脑缺氧缺血可能是脑内GDNF分泌增加的启动因素之一,本课题组前期通过对7日龄的Wistar大鼠研究发现,HIBD假手术组偶见GDNF表达;单纯缺氧缺血组GDNF于缺氧缺血后12h开始上升,第2d进一步升高,第3d达高峰,第5d有所回落。有研究表明,星形胶质细胞除了表达Na⁺和Ca²⁺通道以外,GluR及GABAR在其细胞膜表明亦有表达,鉴于托吡酯具有抑制Na⁺或/和Ca²⁺通道激活以及调节脑内GluR及GABA平衡之功效。因此,我们推测托吡酯有可能通过作用于星形胶质细胞表达的相应受体,达到保护星形胶质细胞,促进GDNF的分泌,进而起到保护神经元的作用。本课题组的前期研究已证实这一点,我们的研究显示:不同时间托吡酯给药后观察组GDNF的分泌量具有差异性。本课题组前期研究已证明托吡酯用于HIBD的治疗时间窗较短,为缺氧缺血后2h之内,且预防用药优于损伤后用药;托吡酯的脑保护作用与GDNF的分泌增加有直接关系。许多动物实验研究显示托吡酯对脑缺血有明显的治疗作用,剂量多在50mg/kg-200mg/kg之间,并未产生损伤边缘系统及影响骨骼发育等副作用。本课题通过建立HIBD动物模型,借助观察脑损伤后给予不同剂量托吡酯对脑组织病理学改变、GDNF动态表达水平等方面的影响,进一步探讨托吡酯脑保护作用的机制、用药剂量,为托吡酯临床治疗HIE提供强有力的理论和试验依据,为HIE的治疗开辟一条新的道路。目的1.观察新生大鼠各处理组相同时间点脑组织的病理学改变。2.观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后GDNF表达水平的动态变化及不同剂量托吡酯干预对GDNF表达的影响。3.探讨托吡酯脑保护作用的机制。方法1.120只新生7日龄Wistar大鼠随机分为假手术组、单纯缺氧缺血组及托吡酯治疗组,托吡酯治疗组根据不同给药剂量分为50mg/kg、100mg/kg及150mg/kg治疗组。2.建立HIBD动物模型。3.给药及处理方法（1）托吡酯治疗组:将托吡酯溶于注射用水配成2%溶液,采用小型灌胃器灌胃。不同剂量托吡酯治疗组分别于手术前30min给予1次、HIBD模型建成后即刻给予1次、之后每隔12h各一次,直至第5d。（2）单纯缺氧缺血组和假手术组同一时间点给予等体积的生理盐水。（3）各组均在缺氧缺血后12h、2d、3d、5d分别处死1/4的动物。4.应用HE染色、免疫组织化学（Immunocytochemistry）及Western Blotting等试验方法,观察和测定研究指标。结果1.HE染色结果假手术组脑组织结构层次清晰,细胞轮廓清楚,核居中,尼氏体位于核周边;单纯缺氧缺血组在缺氧缺血后12h缺血侧皮质、纹状体出现轻微的病理变化,第2d病变最严重,表现为皮质、纹状体、海马、丘脑大片坏死区,第3d病变减轻,出现胶质细胞增生,第5d基本上未见破裂细胞,出现大片胶质瘢痕;50mg/kg、100mg/kg和150mg/kg托吡酯治疗组术后12h上述部位病变不明显,第2d出现轻微病变,表现为极少数细胞间隙增宽,细胞核浓缩,第3d、5d未见明显病灶;其中150mg/kg托吡酯治疗组脑损伤减轻程度较100mg/kg托吡酯治疗组明显,而100mg/kg托吡酯治疗组又优于50mg/kg托吡酯治疗组,50mg/kg托吡酯治疗组较单纯缺氧缺血组脑损伤程度减轻。2.免疫组织化学假手术组仅见较少的GDNF阳性细胞表达,着色较浅,稀疏地分布于整个大脑皮质、纹状体、海马,双侧对称,各时间点上检测未见明显的动态变化;单纯缺氧缺血组和托吡酯各治疗组非缺血侧GDNF阳性细胞染色的程度、数量及变化情况均类似于假手术组;单纯缺氧缺血组缺血侧皮质GDNF阳性细胞在损伤后12h开始表达,第2d进一步上升,第3d达高峰,第5d基本恢复正常,仅见极少量的GDNF表达;50mg/kg、100mg/kg和150mg/kg托吡酯治疗组缺血侧皮质在损伤后12h即可见较多GDNF表达,第2d进一步增加,第3d达高峰,第5d有所减少,但还可见较多的表达,且150mg/kg托吡酯治疗组GDNF的表达尤为明显,托吡酯治疗组在每个时间点上GDNF的表达均明显高于单纯缺氧缺血组（P＜0.05）。GDNF的表达增加与托吡酯成剂量正相关,有统计学意义（各时相点相比均P＜0.05）。3.Western blotting单纯缺氧缺血组与托吡酯各处理组均有GDNF蛋白表达条带,150mg/kg托吡酯治疗组蛋白表达明显高于单纯缺氧缺血组,100mg/kg托吡酯治疗组稍弱,50mg/kg托吡酯治疗组较差。应用生物凝胶电泳图像分析系统（Alphaimager2200）扫描定量,通过计算出各组蛋白表达的相对积分值作出蛋白的相对含量,经过统计学处理发现:50mg/kg、100mg/kg和150mg/kg托吡酯治疗组各时间点上蛋白表达均高于单纯缺氧缺血组,有统计学意义（P＜0.05）;GDNF的表达增加与托吡酯成剂量正相关,有统计学意义（各时相点相比P均＜0.05）。结论1.托吡酯可以明显减轻缺氧缺血导致的脑细胞水肿、液化、坏死,发挥较好的脑保护作用,托吡酯对神经元的保护作用呈剂量正相关。2.托吡酯可使缺氧缺血性脑损伤后GDNF表达升高,其表达升高程度与托吡酯呈剂量正相关。3.增加胶质细胞分泌GDNF可能是托吡酯脑保护作用机制之一。