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背景和目的:鞘氨醇激酶(Sphingosinekinase,SphK)/磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phosphate,S1P)/磷酸鞘氨醇受体(S1Preceptors,S1PRs)系统参与了很多重要的生物学过程,如:细胞生长、增殖、迁移和分化等。本实验室的前期研究证实,肝纤维化时SphK1mRNA表达量和活性均显著上调,同时SphK催化生成的产物S1P含量也显著增加。大量的研究已证实,肝纤维化时骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells,BMSCs)能够迁移到纤维化肝脏,分化为肌成纤维细胞。但是对于SphK/S1P/S1PRs系统在BMSCs向肝脏肌成纤维细胞分化过程中的作用却知之甚少。本研究拟结合体内和体外实验,以SphK/S1P/S1PRs系统为靶分子,探讨其在BMSCs向肝脏肌成纤维细胞分化过程中的作用。
方法:
体外实验:应用原代培养的小鼠BMSCs,以转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)为刺激因子,经体外处理BMSCs后检测肌成纤维细胞标志物-平滑肌肌动蛋白α(α-smoothmuscleactin,α-SMA)、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达情况和细胞中羟脯氨酸的含量,并检测TGF-β1对于SphK1表达的影响。同时,分别采用SphK和S1PRs的特异性激动剂、拮抗剂,或者转染相应的siRNA预处理细胞,检测SphK对于TGF-β1诱导的BMSCs向肌成纤维细胞分化的重要作用,并鉴定参与介导BMSCs分化的S1PR类型。
体内实验:ICR小鼠经射线照射后通过尾静脉移植带有绿色荧光蛋白的BMSCs和普通全骨髓细胞的混合细胞悬液,4周完成骨髓重建后腹腔注射CCl4制成肝纤维化模型,对纤维化肝组织进行SphK1的免疫荧光染色,并且应用一元线性回归分析肝组织中TGF-β1和SphK1mRNA表达之间的相关性。另外一组ICR小鼠在CCl4诱导肝纤维化前一天给予10mg/kg体重的SphK抑制剂SKI,取肝组织,应用免疫荧光染色的方法鉴定并统计BMSCs来源的肌成纤维细胞的百分比。用real-timeRT-PCR的方法检测肝组织中α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达水平。同时对肝组织进行天狼猩红和苏木素-伊红染色,分别评估肝脏纤维化程度及炎症、坏死程度。
结果:
1.体外实验中,TGF-β1上调BMSCs中α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达,呈剂量依赖性,同时增加细胞中羟脯氨酸含量,证明TGF-β1诱导了BMSCs向肌成纤维细胞分化;
2.TGF-β1上调BMSCs中SphK1的mRNA和蛋白表达;
3.SphK1的抑制剂或特异性siRNA明显抑制了TGF-β1诱导的BMSCs向肌成纤维细胞的分化;
4.应用受体拮抗剂或RNA干扰技术,证明S1PR1和S1PR3,而不是S1PR2参与了TGF-β1诱导的BMSCs向肌成纤维细胞的分化;
5.体内实验中,SphK1表达于肝脏纤维化区域的BMSCs,并且肝组织中TGF-β1和SphK1的mRNA表达呈现高度正相关;
6.SphK抑制剂SKI明显抑制了BMSCs向肝脏肌成纤维细胞的分化,并且减轻了肝脏纤维化程度以及肝脏的炎症和坏死情况。
结论:SphK1/S1P/S1PR1/3系统参与了肝纤维化时BMSCs向肝脏肌成纤维细胞的分化,提示以此系统为作用靶点有望设计出新的抗纤维化药物。