目的:原发性肾病综合征（Primary Nephrotic Syndrome,PNS）是儿童常见的原发肾小球疾病,也是引起我国儿童终末期肾病的重要疾病之一。由于其病因的复杂性及异质性,目前对于该病发病机制的认识仍十分有限。近年来的相关研究结果提示免疫功能紊乱及免疫炎症是PNS发病的重要机制,多种固有及适应性免疫应答异常可能参与PNS的发生发展,其中T细胞相关免疫应答失调的作用近年来越来越受到关注,被认为是介导PNS发生发展的核心环节之一。调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）是CD4+T细胞的亚群之一,以转录因子Foxp3表达为标志,具有强大的免疫抑制能力,在机体外周免疫耐受及免疫稳态的建立与维持中发挥核心作用。前期研究显示,PNS患儿急性期外周血中Treg水平下调,提示Treg应答异常参与PNS发生发展。同时既往的研究显示,在多种自身免疫、免疫紊乱及相关炎症条件下,存在Treg细胞谱系稳定性,可塑性及功能异常。但是,目前在肾病综合征、免疫相关肾病及相关动物模型中尚缺乏相关研究报道。故本研究目的主要为明确PNS条件下,Treg细胞是否存在谱系稳定性,可塑性及功能异常,并分析导致以上异常的潜在分子机制。以期加深对于PNS免疫发病机制的认识,同时为临床干预寻找新的靶标。方法:收集重庆医科大学附属儿童医院肾脏内科收治的初诊PNS患儿急性期外周血标本（PNS组）,同时在本院体检中心收集年龄性别相匹配的健康儿童外周血标本作为对照（HC组）:通过流式细胞术,分析Treg细胞相关免疫表型;通过分离纯化外周血Treg细胞、体外刺激其活化及增殖,分析Treg细胞稳定性及可塑性;通过分离纯化外周血Treg细胞及Tresponder细胞,体外共培养,分析Treg细胞的免疫抑制能力;通过分离纯化外周血Treg细胞,基因表达谱及生物信息学分析,磷酸化流式等检测,解析导致PNS条件下Treg异常的潜在信号通路及分子机制;通过分离纯化外周血Treg细胞,特异性抑制剂干预及体外功能、稳定性、可塑性实验,进一步明确相关分子机制在PNS-Treg细胞稳定性,可塑性及功能异常中的关键作用。结果:（1）PNS患儿外周血中Treg细胞谱系核心转录因子Foxp3表达稳定性显著受损,表现为PNS组中CD25+Foxp3-细胞比例显著升高,Treg细胞中Foxp3表达水平显著下降,同时体外稳定性实验提示,PNS-Treg细胞增殖过程中存在Foxp3表达的显著丢失;（2）PNS患儿外周血中Treg细胞表现出显著的可塑性异常,表现为表达IFN-γ、T-bet、及CXCR3的Th1样Treg细胞水平显著升高,同时体外可塑性实验提示,PNS-Treg细胞增殖过程中,伴随Foxp3表达的下调,Treg细胞显著向分泌IFN-γ的Th1样Treg细胞转化,甚至完全转分化为Th1细胞;（3）PNS患儿外周血中Treg细胞存在显著的功能失调,表现为对Tresponder细胞体外增殖的抑制能力显著减弱;（4）Treg细胞的以上异常应答,与过度活化诱导的耗竭状态紧密相关,表现为与Treg及conventional T细胞活化及耗竭相关的分子标志显著上调,同时基因表达谱及生信分析也显示大量活化及耗竭相关的基因集在PNS-Treg细胞中显著富集;（5）介导T细胞活化的TCR信号,及其下游的PI3K-AKT、MAPK信号通路在体外活化后的PNS-Treg细胞中显著富集,提示以上信号通路的异常活化,参与PNS中过度活化诱导的Treg耗竭。（6）作为PI3K-AKT、MAPK信号通路下游的共同调控靶点,m TORC1的活化水平在体外活化后的PNS-Treg细胞中显著上调。（7）m TORC1诱导的下游转录因子,c-Myc及SREBPs的蛋白表达水平在体外活化后的PNS-Treg细胞中显著上调,且受以上转录因子调控的靶基因集亦在体外活化后的PNS-Treg细胞中显著富集,提示m TORC1-c-Myc/SREBPs可能是介导PNS条件下过度活化诱导的Treg耗竭及相关免疫应答异常的关键下游环节;（8）特异性抑制剂干预m TORC1、c-Myc、及SREBPs可显著恢复PNS-Treg细胞的体外抑制能力,下调活化诱导的耗竭标志PD-1的表达。显著改善PNS-Treg细胞体外增殖中的Foxp3稳定性异常,并抑制其IFN-γ的分泌,即减弱PNS-Treg的可塑性异常;（9）基因表达谱及生物信息学分析提示,多种生物合成以及生物能量产生相关的代谢通路在体外活化后的PNS-Treg细胞中显著富集,提示这些异常活跃的代谢程序在活化诱导的PNS-Treg耗竭过程中可能发挥关键作用。结论:以上研究结果提示,PNS病理条件下,外周血Treg细胞表现出明显的功能、稳定性及可塑性异常。PNS-Treg细胞以上应答异常与过度活化诱导的耗竭状态紧密相关。TCR介导的m TORC1信号异常激活在此过度活化诱导的耗竭过程中发挥不可或缺的作用。同时,此过程中可能伴随有多种生物合成及生物能量产生相关的代谢通路的异常活跃。目的:将牛奶蛋白诱导的过敏性直肠结肠炎（cow’milk protein induced FPIAP,CM-FPIAP）婴儿的肠道菌群移植给无菌小鼠,通过检测受体小鼠肠道内菌群结构及免疫微环境的变化,研究非IgE介导型牛奶蛋白过敏中肠道菌群失调对调节性T细胞介导的免疫耐受和免疫稳态的影响。方法:收集明确诊断为牛奶蛋白诱导的过敏性直肠结肠炎婴儿（I-FPIAP组）及健康对照婴儿（I-HC组）的粪便标本,分别移植给无菌小鼠（M-FPIAP组和M-HC组）。两周后通过16S r RNA基因测序确认供体婴儿的菌群结构在受体小鼠肠道内的保持情况;通过流式细胞术分析受体小鼠肠道Treg细胞应答相关的免疫表型及肠道免疫稳态相关指标,并通过分离纯化及体外共培养技术分析受体小鼠肠道Treg细胞的免疫抑制功能;最后通过相关性分析,寻找CM-FPIAP条件下,可能影响Treg细胞免疫应答及免疫稳态的菌属。结果:1.菌群定植2周后,供体婴儿肠道菌群的主体结构在受体小鼠肠道内较能保持;2.M-FPIAP组小鼠结肠总Treg细胞、p Treg细胞、Ro R-γt+Treg细胞水平显著下降,Treg细胞的增殖及凋亡指标无显著差异;3.M-FPIAP组小鼠结肠Treg细胞表达ICOS、CTLA4的量显著下降,Treg细胞活化水平显著下调,抑制性细胞因子IL-10的分泌水平明显减少,同时对Responder T细胞体外增殖的抑制能力显著减弱;4.M-FPIAP组小鼠结肠T细胞活化水平显著提高,且主要表现为Th2型免疫应答;5.相关性分析显示,Raoultella及Clostridium sensu stricto两个菌属的丰度都与结肠Treg水平及功能呈高度负相关。结论:1.作为非IgE介导型CMPA的主要临床类型,CM-FPIAP中的菌群失调会显著地破坏肠道Treg细胞的发育及功能,影响Treg细胞参与维持的肠道免疫耐受和免疫稳态。2.Raoultella及Clostridium sensu stricto的丰度增加对肠道Treg细胞发育及功能的异常可能产生关键影响。目的:以Dock8缺陷病人外周血单个核细胞及Dock8基因敲除小鼠为研究对象,初步探讨Dock8这一鸟苷酸交换因子缺乏对B细胞活化早期关键分子事件及记忆B细胞活化的影响,以期深化对于Dock8缺陷病人体液免疫异常发病机制的理解与认识。方法:分离及纯化Dock8缺陷病人外周血及Dock8基因敲除小鼠脾脏B细胞,通过可溶性抗原-磷酸化流式系统及膜相关抗原-TIRFm系统,分析Dock8缺陷对总B细胞或记忆性B细胞（CD19+CD27+）早期活化相关信号转导、BCR动力学、及细胞形态学的影响;通过流式细胞术分析Dock8缺陷对体外活化所诱导的初始B细胞表型转变的影响;通过流式细胞术,RT-PCR,分析Dock8缺陷对B细胞活化共受体CD19及Dock8下游效应分子WASP表达的影响。结果:相较于野生型小鼠,Dock8基因敲除小鼠B细胞中早期活化关键信号分子的磷酸化水平（p Btk,p CD19）,及BCR信号相关蛋白酪氨酸磷酸化总体水平p Y,在活化后不同时间点均显著下调,反应Dock8敲除小鼠B细胞早期活化显著受损;体外活化后,Dock8下游效应分子WASP的磷酸化水平（p WASP）在Dock8敲除小鼠B细胞中亦显著下调;Dock8缺陷小鼠B细胞中共受体CD19的转录水平显著下调;Dock8缺陷小鼠B细胞中WASP的转录及蛋白水平亦显著下调。与健康对照相比,Dock8缺陷病人外周血B细胞体外活化后,p CD19、p Btk、p Y、p WASP及肌动蛋白F-actin水平均显著下调,这与小鼠模型观察到的结果呈现一致性,提示Dock8缺陷病人外周B细胞早期活化显著受损;同时,TIRFm结果显示,膜相关抗原激活后,Dock8缺陷病人外周血记忆B细胞早期活化亦显著受损,表现为:记忆B细胞与膜相关抗原接触区域内BCR聚集簇及B细胞扩张受限,BCR信号分子的招募及活化（p Y,p Btk）受损;磷酸化流式也显示,可溶性抗原激活后,Dock8缺陷病人外周记忆B细胞中Erk及Btk的磷酸化水平显著下调,进一步证实其早期活化受损;同时,体外活化诱导的初始B细胞向记忆B细胞表型转变,在Dock8缺陷病人中亦显著受限;流式结果显示Dock8缺陷病人外周记忆B细胞中CD19表达显著下调。结论:以上结果显示Dock8缺陷将显著损害总B细胞及记忆B细胞的早期激活;且以上效应可能是通过抑制共受体CD19或Dock8下游效应分子WASP的表达及活化得以实现。