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研究背景：白血病(leukemia)是一类以恶性克隆性白血病细胞增殖异常、分化障碍、凋亡受阻和正常造血受抑制为特点,严重威胁人类健康的造血系统恶性疾患。随着近年来各种治疗方法的发展,白血病化疗的完全缓解率(complete remission, CR)有所提高,但仍有60～70%的患者治疗失败或复发,其治疗失败和复发的重要原因是多药耐药(multi-drug resistance, MDR)的产生。白血病耐药机制非常复杂,其中抗凋亡蛋白异常高表达是导致MDR的重要原因之一。髓细胞白血病1基因(myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related), MCL1)是近年来发现的一种抗凋亡基因,属BCL2家族成员。MCL1与BCL2和BCL2L1作用类似,能与BAX、BAK1相互作用,从而抑制线粒体途径的凋亡。研究显示,MCL1基因在多种血液系统肿瘤(如慢性淋巴细胞白血病)和实体肿瘤(如肝细胞癌、非小细胞肺癌、乳腺癌)中表达异常增加,且MCL1基因的表达水平与肿瘤的分级、预后密切相关。此外,有研究报道,在儿童急性淋巴细胞白血病中,MCL1的表达与患者对强的松的敏感性显著相关。提示MCL1基因可能在白血病耐药中发挥重要作用。研究目的：研究MCL1基因在急性白血病患者中的表达水平；探讨MCL1异常表达对白血病细胞药物敏感性及药物诱导凋亡的影响；阐明MCL1基因在白血病多药耐药机制中的作用,为逆转白血病多药耐药提供新的靶点。研究方法：1.标本采集：收集47例急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的骨髓标本,分为初诊/难治/复发组(27例)和完全缓解组(20例)。应用淋巴细胞分离液分离标本中的单个核细胞,Real time RT-PCR检测骨髓中MCL1的表达。2. MCL1真核表达载体的构建：应用RT-PCR技术从白血病多药耐药细胞系K562/A02中扩增MCL1基因的编码序列,将其插入到pLXSN载体中,构建成MCL1真核表达载体pLXSN-MCL1。3.细胞转染：应用LipofectamineTM2000将MCL1表达载体转染AML细胞系K562、HL60和ALL细胞系Jurkat。应用G418筛选至少2周获得稳定转染的细胞。应用Real time RT-PCR和Western blot分析转染前、后MCL1 mRNA和蛋白的表达变化。4. Real time RT-PCR检测MCL1 mRNA表达：应用TRIzol方法提取细胞总RNA,使用M-MuLV逆转录酶将RNA逆转录为cDNA,应用Real time PCR检测细胞转染前、后MCL1基因mRNA水平的表达。5. Western blot检测MCL1蛋白表达：应用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白,12% SDS-PAGE胶进行凝胶电泳,Western blot方法检测转染前、后细胞MCL1蛋白水平的表达。6.MTT方法检测细胞对化疗药物敏感性：将转染前、后的细胞接种于细胞培养板中,加入不同浓度的化疗药物阿霉素孵育72小时,MTT方法检测细胞对化疗药物的敏感性,计算阿霉素的半数抑制浓度(IC50值)。7.流式细胞术检测细胞凋亡：将转染前、后的细胞接种于细胞培养板中,加入化疗药物阿霉素孵育72小时,收集细胞,AnnexinV/PI双染后利用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。研究结果：1.急性白血病患者MCL1表达情况：在初诊/难治/复发组27例患者中,13例(48%)患者高表达MCL1,而在完全缓解组20例患者中,仅4例(20%)患者高表达MCL1,差异有统计学意义。2. MCL1真核表达载体能有效上调细胞中MCL1的表达：将pLXSN-MCL1表达载体稳定转染K562、HL60、Jurkat细胞后,Real time RT-PCR显示MCL1 mRNA的表达水平较对照组分别增高3.3、6.3、9.6倍；Western blot显示MCL1蛋白的表达水平较对照组亦显著增高。3. MCL1表达上调后细胞对药物敏感性的变化：MTT检测发现,K562、HL60、Jurkat细胞转染pLXSN-MCL1表达载体后,阿霉素IC50值分别为103.05±5.79,58.11±0.92,53.12±0.64μg/L,而对照组阿霉素IC50值分别为40.60±2.90,18.14±1.07,23.27±0.75μg/L，表明高表达MCL1使细胞对阿霉素的药物敏感性降低。4. MCL1表达上调后药物诱导的细胞凋亡变化：K562、HL60、Jurkat细胞转染pLXSN-MCL1表达载体后,阿霉素诱导的细胞凋亡率分别为44.18±4.54%、20.81±6.17%、29.56±2.82%,而对照组的细胞凋亡率分别为87.69±5.77%、45.46±2.56%、70.91±9.30%,表明转染后药物诱导的细胞凋亡减低。结论：1.初诊、难治和复发的急性白血病患者MCL1表达水平较完全缓解的患者明显增高,提示MCL1可能在急性白血病的发生、发展中起作用。2. MCL1异常高表达可降低白血病细胞对化疗药物的敏感性。3. MCL1异常高表达可导致化疗药物诱导的细胞凋亡率降低。4. MCL1在白血病耐药中发挥重要作用,有望成为白血病治疗的新靶点。研究背景：白血病是一类严重影响人类健康的血液系统恶性疾患,其发病机制多种多样,部分白血病患者伴有染色体核型异常,是导致其发病的重要原因。AFlq基因(又名MLLT11)最初是在2名伴有t(1；11)(q21；q23)的急性髓系白血病患者中发现的,该染色体易位形成了MLL/AF1q融合基因,从而促进白血病的发生研究显示,AF1q基因的表达水平在AML和ALL患者中普遍升高,且AF1q高表达在儿童AML、成人正常核型AML及骨髓增生异常综合症(MDS)中是一个预后不良指标。然而,AF1q基因表达的调控机制目前并不清楚。MicroRNA (miRNA)是近年来发现的一类长度为19-25nt,序列高度保守的内源性非编码小RNA分子。成熟miRNA能与靶基因mRNA的3’非翻译区(UTR)结合,引起靶基因mRNA的降解或翻译抑制,从而下调靶基因蛋白的表达。目前在人类中已经发现700多种miRNA分子,平均每个miRNA能调节200种基因的表达,对至少1/3的人类基因起重要的调节作用。研究显示,miRNA在白血病中存在异常表达,且与白血病细胞的生长、增殖、凋亡密切相关,可作为临床分型、分期的标准,能提示患者的预后情况。因此,我们推断AFlq基因的表达很可能受某种miRNA调控。研究目的：研究在白血病中可能调控AFlq基因表达的miRNA分子；探讨miR-29b在白血病细胞AF1q表达调控中的作用,阐明其作用机制,为白血病提供新的预后指标。研究方法：1.计算机预测miRNA:应用TargetScanHuman和miRGen软件预测可能调控AFlq基因表达的：miRNA。2.标本采集：收集56例AML患者的骨髓标本,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,应用生物芯片技术(Microarray)和Real time PCR检测患者miR-29b、AFlq的表达情况,分析miR-29b表达水平与AML患者预后的关系。3.载体构建及转染：从细胞mRNA中扩增出AF1q基因3’UTR片段及3’UTRmiR-29b结合位点突变片段,将其插入载体pEGFP-C1中,构建成GFP报告质粒pGFP-A3U及pGFP-A3U-M。应用LipofectamineTM 2000将GFP报告质粒转染H157细胞,G418筛选新霉素抗性细胞,流式细胞术分选GFP阳性细胞。4. Mimic细胞转染：应用LipofectamineTM 2000将miR-29b mimic及阴性对照mimic转染白血病细胞系REH和两种肺癌细胞系H157、SKMES1,72小时后收集细胞,应用Real time RT-PCR检测转染后AF1q基因mRNA表达,Western blot检测AF1q蛋白表达。5. Real time RT-PCR:应用TRIzol方法提取细胞总RNA,逆转录试剂盒获得cDNA, Real time PCR检测AF1q、GFP、β2M基因mRNA水平的表达。6. Western blot:GLB细胞裂解液裂解细胞总蛋白,4-12% NuPAGE胶进行凝胶电泳,Western blot方法检测AF1q蛋白水平的表达。研究结果：1.计算机预测显示miR-29a/b/c与AF1q基因3’UTR完全匹配,可能是调控AF1q基因表达的miRNA。2. Microarray显示：56例AML患者中miR-29b的表达水平与AF1q基因表达水平呈负相关,即低表达miR-29b的患者存在AF1q高表达,且低表达miR-29b的AML患者总生存率较miR-29b高表达的患者差。3.将miR-29b转染REH、H157和SKMES1细胞后,Real time RT-PCR显示AF1q mRNA的表达水平较阴性对照组降低,Western blot显示AF1q蛋白表达水平较阴性对照组下调。4.将GFP报告载体pGFP-A3U及pGFP-A3U-M转染H157细胞后,Real time RT-PCR显示转染AF1q 3’UTR的细胞,报告基因GFP表达水平较AF1q 3’UTR miR-29b结合位点突变细胞明显下调。结论：1.AML患者中miR-29b的表达与AF1q基因表达呈负相关。2. MiR-29b可调控白血病细胞中AF1q基因的表达。3. MiR-29b通过作用于AF1q的3’UTR调控基因表达。