本文在离体组织、细胞、分子三个层次，从一氧化氮-环鸟苷酸(NO-cGMP)信号通路的角度，并结合其所具有的抗氧化、清除氧自由基的性质，探讨小檗碱舒张阴茎海绵体的作用及其机制，为临床应用提供实验依据。　　一、小檗碱对兔离体阴茎海绵体的舒张作用及机制　　本文采用离体平滑肌张力变化记录技术观察小檗碱对离体兔海绵体肌条的作用。结果发现，在兔离体阴茎海绵体平滑肌标本上(1)Ber、西地那非(sildenafil，Sild)、罂素碱(papaverine，Pap)及氨力农(amrinone, Amr)均可浓度依赖性地引起舒张效应，其作用强度依次为Sild＞Ber＞Pap＞Amr，EC50分别为0.84，6.20，15.00和27.69μmol·L-1(2)当NO合酶抑制剂L-NAME（0.1mmol·L-1）存在时，Ber的最大舒张效应由100.0％降低到84.0±3.4％。当同时加入L-Arginine(1mmol·L-1)时，可部分对抗L-NAME的作用，小檗碱对海绵体的最大舒张效应可恢复到96.0±4.5％。(3)Ber(1，10μmol·L-1)浓度依赖性地增强ACh引起的舒张效应，ACh的最大效应分别由72.0±3.6％升高到81.0±4.0％或93.0±6.3％。(4)Ber（1，10μmol·L-1）对KCl去极化引起的收缩反应的作用微弱（P＞0.05）。提示Ber对兔海绵体具有浓度依赖性舒张作用，其机制与影响NO-cGMP信号通路有关。　　二、小檗碱对兔阴茎海绵体环核苷酸水平的影响　　环核苷酸cAMP和cGMP是普遍存在于生物体内的第二信使。现知NO-cGMP信号通路在阴茎勃起中起着关键的调控作用，此信号通路活性的增强，会导致cGMP水平的升高。为了深入研究小檗碱的作用机制，采用125I放射免疫测定法，在不同的条件下，即无激发剂、cGMP激发剂硝普钠(SNP)和cAMP激发剂前列腺素E1(PGE1)存在时，以Sild为阳性对照，观察Ber对家兔阴茎海绵体平滑肌组织中cGMP和cAMP水平的影响。结果表明:Ber能直接升高cGMP的含量(P＜0.05)，但对cAMP含量无显著影响。在cGMP激发剂硝普钠(SNP)存在下，Ber能浓度依赖性地提高海绵体组织中cGMP浓度(P＜0.01)，促进cGMP生成的EC50分别为1.32μmol·L-1。同样的条件下，Ber对cAMP的浓度无显著影响（P＞0.05）。在cAMP激发剂PGE1刺激下，Ber也能够提高海绵体组织中cAMP的浓度(P＜0.01)，表现出浓度依赖性，促进cAMP生成的EC50为4.90μmol·L-1。提示:Ber的可通过提高阴茎海绵体平滑肌中cGMP及cAMP的浓度，从而舒张海绵体。　　三、小檗碱对大鼠阴茎海绵体NOS mRNA水平的影响　　一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是NO合成的关键酶，它通过调节NO的合成在阴茎平滑肌舒张中起到关键性作用。迄今已明确的NOS亚型有3种，即神经细胞型(nNOS)、内皮细胞型(eNOS)和诱生性(iNOS)。已有的研究表明，nNOS基因敲除的小鼠能保持正常的勃起和生育功能，并且eNOS的表达呈代偿性增加，说明在维持阴茎勃起过程中eNOS的作用更基础。有关阴茎勃起过程中iNOS的功能目前尚不明确。最新研究发现，iNOS也存在大鼠动脉内皮细胞和阴茎海绵体平滑肌细胞中。目前研究提示，NOS活性降低与勃起功能障碍有密切的关系。本文以β-actin为内参，采用RT-PCR对大鼠海绵体中NOS同工酶(eNOS和iNOS)的mRNA表达进行检测，并且检验Ber对其是否有调节作用。　　eNOS扩增片段全长228bp，上游引物序列为:5-CTGCTGCCCGAGATATCTTC-3，下游引物序列为:5-CAGGTACTGCAGTCCCTCCT-3;iNOS扩增片段全长424bp，上游引物序列为:5-ATGGCTCCTTCAAAGAGGCAA-3，下游引物序列为:5-TCGATGCACAACTGGGTGAA-3;β-actin扩增片段全长368bp，上游序列为:TC TACAATGAGCTGCGTGTG，下游序列为:AATGTCACGCACGATTTCCC。　　结果表明:大鼠阴茎海绵体中有eNOS和iNOS mRNA的表达。与内参照β-actin相比，对照组、Ber孵育1小时和3小时组的eNOS和iNOS基因mRNA的相对表达量分别为:0.56±0.04，0.28±0.01;0.78±0.01，0.29±0.03;0.93±0.05，0.29±0.01。用药后eNOS mRNA表达较之对照组增加，Ber孵育1小时组eNOS基因mRNA增加了40％，3小时组增加了66％(P＜0.01)。但是，相同条件下，Ber对iNOS基因mRNA的相对表达无影响。提示: Ber对NO-cGMP上游关键酶NOS具有一定的调控作用，增加eNOS的mRNA的表达可能为Ber舒张阴茎海绵体平滑肌的分子机制之一。　　四、小檗碱对大鼠肝脏鸟苷酸环化酶活性的调节:小檗碱在舒张阴茎海绵体平滑肌中的作用　　NO是舒张阴茎海绵体平滑肌的主要神经递质，其靶分子为可溶型鸟苷酸环化酶(sGC)。sGC由α和β二个亚基组成，尽管每个亚基均含有催化基团和血红蛋白结合基团，但需两亚基结合时酶才有活性。NO刺激海绵体平滑肌细胞内的sGC，使GTP转化为第二信使cGMP，增加细胞内cGMP的含量，发挥生物学效应。因此，直接刺激sGC导致cGMP水平的增加可能有助于舒张阴茎海绵体平滑肌。　　本文观察了Ber对大鼠肝脏鸟苷酸环化酶活性的调节，发现Ber能直接增加sGC的活性（P＜0.05）;在硝普钠(SNP)存在下，Ber显著增加海绵体组织中sGC的活性（P＜0.01），EC50为1.11μmol·L-1。提示:Ber可增强大鼠肝脏sGC的活性，此作用可能是Ber舒张阴茎海绵体平滑肌的潜在机制。　　五、小檗碱对大鼠阴茎海绵体磷酸二酯酶5 mRNA水平的影响　　尽管只有cGMP和cAMP两种底物，在哺乳动物组织中磷酸二酯酶(Phosphodiesterases，PDEs)有多达11个家族成员(PDE1-PDE11)，由21个基因编码而来，每个基因编码多个异构酶。这11种PDEs中PDE5，6和9仅水解cGMP。除了PDE6，所有的PDE无论在RNA或蛋白质水平，都已经在人的阴茎海绵体检测到;然而，只有PDE5显示出明确的调节勃起功能的作用。现在已经从人阴茎海绵体克隆出3种PDE5的同工异构酶，结构上，这些异构酶的差异只是表现在mRNA的5端，以及与之相对应的蛋白质末端的氨基酸。虽然人的PDE5A3特异性等位基因已在大鼠的PDE5A基因定位，但是人们克隆推测中的大鼠PDE5A3异构酶的努力至今未获成功。因此，本文以β-actin为内参，采用RT-PCR对大鼠海绵体中PDE5同工酶(PDE5A1和PDE5A2)的mRNA表达进行检测，并且检验Ber对其是否有调节作用。　　PDE5A1扩增片段全长345bp，上游引物序列为:TGATCACCGGGACTTTACCT; PDE5A2扩增片段全长327bp，上游引物序列为:TGCTATGTTGCCCTTTGGAG，PDE5A1和PDE5A2共同的下游引物序列为:GAGCACTGGTCCCCTTCA。β-actin扩增片段全长368bp，上游序列为:TCTACAATGAGCTGCGTGTG，下游序列为:AATGTCACGCACGATTTCCC。　　结果表明，大鼠阴茎海绵体中有PDE5A1和PDE5A2 mRNA的表达，以PDE5A2为主要的同工酶。与内参照β-actin相比，对照组、Ber孵育1小时和3小时组的PDE5A1及PDE5A2基因mRNA的相对表达量分别为:0.22±0.02，0.41±0.01;0.15±0.01,0.34±0.02;0.10±0.01,0.12±0.01。用药后PDE5A1和PDE5A2的mRNA表达较之对照组减少，Ber孵育1小时组降低了32％(PDE5A1)和17％(PDE5A2)，3小时组降低了55％(PDE5A1)和71％(PDE5A2)，其中尤以应用Ber3小时后PDE5A2的mRNA减少最为明显(P＜0.01)。提示:Ber对NO-cGMP信号通路的下游关键酶(PDE5)具有一定的调控作用，尤其是抑制PDE5A2的mRNA表达，可能为Ber舒张阴茎海绵体平滑肌的分子机制之一。　　六、小檗碱对H2O2引起家兔阴茎海绵体细胞损伤的保护作用　　阴茎的勃起依赖于勃起组织和阴茎动脉中血管平滑肌的舒张，而NO是主要的神经递质。有研究表明过氧化物和其他的ROS所介导的氧化应激可损害海绵体的功能，如过氧化物可通过灭活NO而损害阴茎组织内NO的传递及随后的平滑肌舒张，并且，ROS可损伤内皮细胞导致动脉粥样硬化，导致血管性ED的发生。本文建立活性氧(H2O2)诱导家兔阴茎海绵体平滑肌细胞损伤的模型，采用MTT比色法，观察Ber对平滑肌细胞存活率的影响，并且检测细胞中MDA、LDH、SOD、NO等含量的变化。观察Ber抗氧化的作用及探讨其机制。发现:Ber-可提高H2O2损伤时细胞的存活率，减少脂质过氧化产物MDA生成，增加CCSMCs释放NO，减少LDH释放，增加SOD活性。提示:Ber对H2O2引起家兔阴茎海绵体细胞损伤具有保护作用，此作用亦可能有益于Ber治疗勃起功能障碍。