抗微管治疗策略是肿瘤防治领域的研究热点之一。紫杉醇(Paclitaxel,PTX)是常见的微管抑制剂,通过干扰微管的组装、抑制有丝分裂而产生抗肿瘤效应。然而,单纯PTX的临床应用会造成细胞选择性低,亦存在严重的毒副作用。生物纳米技术的出现可为PTX所面临的临床问题提供新的解决途径。以脂质体作为载体携带抗癌药物或基因进入目标细胞,高效治疗肿瘤的同时,可显著降低化疗药物的毒副作用。PTX递送系统的开发,包括使用脂质体,聚合物纳米颗粒,胶束分散体和环糊精复合物,引起生物制药专家的高度关注。纳米药物运输体系(Drug delivery system,DDS)有着利用固有的肿瘤富集特性和在特定位点处控释药物的潜能,可改善药物的靶向递送。本课题探讨了一种在光辐照下高效产生活性氧的脂质体,携载新型光敏剂华卟啉钠(Sinoporphyrin sodium,DVDMS)与抗癌药物PTX,通过光响应性刺激在特定时间、特定空间释放PTX,并从细胞有丝分裂滑脱效应、细胞能量代谢转换等角度阐释光控脂质体增效PTX的可能作用途径。在本研究中,我们分析了光化学催化是如何通过调节磷酸化Mcl-1蛋白的表达来提高PTX的功效,从而增强线粒体依赖性细胞凋亡;同时通过测定线粒体呼吸(氧消耗率,OCR)和糖酵解(细胞外酸释放,ECAR)的速率,分析共载脂质体在光照处理前后的能量代谢变化。所获得研究结论可为克服紫杉醇临床应用中的毒副作用和靶向治疗策略提供相关思路。本论文主要从共载脂质体的设计合成、光控释药、体外细胞毒效应、体内疗效评价等方面展开研究。从以下几个方面概述:第一部分携载华卟啉钠与紫杉醇脂质体的制备与表征研究选择PEG化脂质体的标准制剂作为光敏剂DVDMS和微管抑制剂PTX的药物装载平台,水溶性DVDMS被包封在脂质体的亲水核心内,PTX装载到脂质体疏水脂质双分子层中。实验采用薄膜水化法分别制备紫杉醇脂质体(PL)、华卟啉钠脂质体(DL)、携载华卟啉钠与紫杉醇脂质体(PDL);采用透射电镜和原子力显微镜观察所制备脂质体的形貌特征;用马尔文Nano-ZS90动态光散射粒径分析仪测定不同脂质体粒径、电位和分散系数;荧光分光度法测定脂质体溶液中的单线态氧产率。结果显示:采用氮吹薄膜水化法制备脂质体的操作步骤简单,结果稳定可靠,易重复。通过对所制备的PL、DL、PDL三种脂质体制剂的形态、粒径、PDI、Zeta电位进行研究发现,三种脂质体分布均匀,粒径在100 nm～115 nm,分布范围窄,带有少量负电荷,符合以脂质体作为载药递送中渗透滞留效应的条件,紫杉醇脂质以及紫杉醇与华卟啉钠共载脂质体有效地克服了紫杉醇临床应用在水中的低溶解性、毒副作用强等问题。第二部分建立脂质体携载华卟啉钠与紫杉醇效率的测定方法及光控药物释放特性研究通过紫外分光光度法和荧光分光光度法分别建立PTX和DVDMS含量的测定方法。建立PTX的浓度与其紫外吸收值、DVDMS浓度与其荧光值的线性关系,结果表明所建方法合理。研究采用SephadexG-50凝胶柱层析法,除去游离药物,同时以1%triton-100破坏脂质体结构,分别测定除去游离药物前后脂质体中DVDMS与PTX的含量,计算DVDMS与PTX的包封率。体外药物释放研究:将等量的PL、DL、PDL分别分为对照组和光照处理组,光照处理组设置光密度为30.25 mW/m2,辐照时间132 s;对照组不做任何处理。将处理后的脂质体置于透析袋并于37℃恒温振荡器中以100 rpm的速度振荡,不同时间点取样,采用酶标仪检测样品中PTX/DVDMS含量;计算不同时间点脂质体中药物释放累计百分比并绘制累计释放率-时间曲线。结果显示:(1)PL中PTX的包封率为62.13 ±3.24%,DL中DVDMS的包封率为73.28 ±4.25%,在PDL共载脂质体中PTX与DVDMS的包封率都约52%,二者对应的质量比约为1:1。(2)在0～12 h内,PL中的光处理组,PTX呈缓慢释放状态,而DL和PDL中PTX或DVDMS药物释放呈突释状态,且到达12 h时药物积累释放量达到75.8%;相反,对照组药物缓慢释放,在12 h时药物释放积累量仅有12.3%。第三部分华卟啉钠与紫杉醇共载脂质体体外抗肿瘤效应及相关机制分析体外实验研究选用人乳腺癌MCF-7细胞为模型,采用MTT法、Viacount、AnnexinV/PI等考察PL、DL、PDL分别结合光照处理所产生的细胞毒效应。流式细胞仪结合罗丹明123(Rh123)和DCFH-DA研究在不同处理模式下,线粒体膜电位与活性氧的产量在MCF-7细胞内线粒体膜电位变化和细胞内活性氧的生成。以Rh123替代紫杉醇,合成罗丹明与DVDMS共载的脂质体,利用激光共聚焦显微镜观察共载脂质体中药物在细胞内的分布;采用Seahose能量代谢分析仪检测不同处理模式下,细胞内线粒体呼吸和糖酵解能量代谢改变情况;免疫荧光法检测β-tubulin分布状态;Western blot检测光照分别结合PL、DL、PDL处理后,MCF-7细胞中 Cleaved-Caspase-3、Cleaved-PARP、Mcl-1、Bcl-xL 的表达活性变化。结果表明:(1)药物共载脂质体联合光照处理显示较强的协同杀伤效果,比较分析证实PDL结合光照显著降低了 PTX和DVDMS的半数抑制率。(2)DL、PDL(30 ng/ml,50 ng/ml)结合光照处理后,细胞线粒体膜电位水平均有不同程度的下降,并且PDL(50 ng/ml)联合光照处理组线粒体膜电位下降水平更为显著。(3)在光照情况下,PL组细胞内活性氧水平很低,与对照组相比无明显差异;DL(50 ng/ml DVDMS)组有40.56±2.31%的细胞呈较强的DCF绿色荧光,与对照组(2.31 ±1.54%)相比差异显著(p<0.01);PDL(50ng/mlDVDMS)组细胞内70.54±4.25%的细胞呈阳性DCF绿色荧光,协同处理提升了胞内活性氧水平。(4)Seahose检测MCF-7细胞OCAR和ECAR水平变化反映线粒体氧化磷酸化和糖酵解代谢方式在不同处理后的影响,结果提示PDL联合光照处理可通过抑制胞内糖酵解水平增益PTX细胞毒效应。(5)激光共聚焦观察显示光照处理改变了脂质体携载药物在细胞内的分布变化,可能与光控释药,脂质体的溶酶体逃逸相关。(6)PDL联合光照处理严重破坏了 MCF-7细胞微管网络结构,增强了凋亡相关蛋白casepase-3和PARP活化水平,抑制了促存活蛋白Mcl-1表达水平。PDL所携载的DVDMS在光照下发生的光动力反应可通过磷酸化Mcl-1 Ser64位点,促进Mcl-1蛋白酶体依赖性降解,增强PTX引发的细胞周期阻滞和细胞凋亡。第四部分华卟啉钠与紫杉醇共载脂质体体内抗肿瘤效应研究通过建立MCF-7荷瘤小鼠模型,利用活体成像仪评估肿瘤内药物富集趋势,分别从肿瘤体积、小鼠体重、主要脏器观察、形态学检验、免疫组化分析等几个方面探讨PL、DL、PDL联合光照处理对MCF-7移植瘤的生长抑制效应。实验结果表明:注射脂质体12 h后瘤内药物蓄积量达到最大,PDL协同光照显著抑制荷瘤小鼠肿瘤生长;TUNEL检测结果显示联合处理主要通过诱导细胞凋亡发生抑制效应;在所选用剂量和光照参数下,不同处理对小鼠体重和主要脏器无明显影响,提示联合处理具有一定的系统安全性。结论综上,本研究设计了一种光敏性脂质体携载抗微管药物治疗肿瘤的新策略,利用新型光敏剂DVDMS应答光照破坏脂质体,在特定位点释放PTX,同时DVDMS所引发的光动力效应可协同增益PTX效应。体外实验表明DVDMS-光动力一方面可通过促进抗凋亡蛋白Mcl-1降解,抑制PTX导致有丝分裂阻滞可能产生的滑脱效应,进而增强PTX凋亡诱导效应,另一方面可通过抑制细胞糖酵解作用,从而在PTX作用后,防止可能的能量转换来维持细胞生存的现象出现。这种光化学疗法可同时抑制糖酵解和线粒体呼吸,减少细胞内ATP的产生,其潜在的分子机制尚需进一步深入探讨。体内实验表明,在共载脂质体于肿瘤内达到相对较高的富集量时,光照处理促发了肿瘤内PTX的局部释放,极大地提升了 PTX治疗效果并降低系统毒副作用。