小麦CO-like基因TaCO9的克隆、表达分析及功能标记开发

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光周期是引起植物从营养生长转为生殖生长的重要影响因子,在拟南芥中CONSTANS(CO)基因通过调控长日照光周期信号诱导FT(FLOWERING LOCUS T)基因的转录促使开花,该基因在拟南芥的光周期途径中扮演重要角色。关于小麦光周期基因的研究相对水稻等作物较少,对CO基因的研究鲜见报道。小麦基因组复杂,传统的图位克隆难度相对较大,而比较基因组学在禾本科植物中的发展为小麦基因克隆提供了新的思路,参考小麦近缘种相关基因的研究从小麦中克隆相关基因并加以验证是一条高效途径。本研究基于大麦HvCO9基因核酸序列,利用同源克隆技术在小麦中克隆了其同源基因TaCO9并进行了表达分析及功能标记开发。主要结论如下:1.通过PCR技术及单克隆筛选获得全长cDNA及gDNA序列,在普通小麦西农889中TaCO9基因编码的三个同源cDNA序列全长均为870bp,含有两个外显子及一个内含子,编码289个氨基酸,含有CO-like蛋白家族典型的CCT结构域,但不含B-box结构域,与大麦HvCO9基因结构一致。2.三级结构预测表明,TaCO9蛋白与大麦HvCO9及水稻Ghd7蛋白中CCT结构域的NF-YA2较为保守,系统发育树分析表明TaCO9蛋白与大麦HvCO9蛋白及水稻Ghd7蛋白亲缘关系较近。3.构建了普通小麦的原核表达载体pEASYE1-TaCO9,并在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物大小为36kDa,与cDNA翻译氨基酸大小一致。4.通过实时定量PCR对TaCO9基因的表达模式进行初步分析,结果表明该基因在根、茎、叶和穗部均有表达,穗部表达量高,根部表达量极低,相对表达量为叶>茎>穗>根,该结果与大麦HvCO9及水稻Ghd7基因一致。5.对比春性品种宁春4号(开花较早)和冬性品种西农889(开花较晚)三种核酸序列发现,春性品种其中一种序列在距CCT结构域22bp处有6bp的碱基插入,但并未造成移码突变。根据该序列与另两条序列内含子差异设计分子标记,利用中国春缺-四体材料将其定位于小麦1A染色体,命名为TaCO9-1A。6.根据TaCO9基因等位变异开发共显性分子标记在不同小麦品种中扩增,发现具有碱基插入突变的品种普遍为春性品种,抽穗及开花相对于未突变品种较早,冬性品种未发现突变,该标记与小麦冬春性密切关联,可辅助鉴定品种冬春习性。
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