论文部分内容阅读
RNA沉默（RNA silencing）是一种普遍存在于真核生物体内用以抵御病毒和外来核酸入侵的特异性RNA降解机制。针对这一防御机制，病毒通常通过编码RNA沉默抑制子（RNA silencing suppressors, RSSs）阻碍沉默的产生和传播，保证其成功侵染。迄今为止，已经鉴定出80多个RNA沉默抑制子，其中大多数来自植物病毒。已鉴定的RSSs大多为蛋白质，它们之间没有序列同源性，结构上也表现高度多样，这反映出RNA沉默机制及病毒、寄主互作的复杂性。因此，更多新的沉默抑制子的鉴定及功能分析，有利于深入细致地了解RNA沉默机制及寄主、病毒互作规律，为更有针对性控制病毒提供理论基础；另外，筛选获得的沉默抑制子与目的基因共表达，可以提高蛋白表达水平，为异源蛋白表达研究提供新策略。本研究选取6种禽类病毒编码蛋白，利用农杆菌瞬时表达系统，对其RNA沉默抑制功能进行鉴定，并对其中沉默抑制功能明确的HVT063和NS1的沉默抑制特点及作用机理进行了分析。主要研究结果如下：（1）候选RNA沉默抑制蛋白的初步筛选鉴定。根据已知RNA沉默抑制子多为dsRNA（double-stranded RNA,双链RNA）、siRNA（small interfering RNA,小分子干扰RNA）结合蛋白或致病相关因子等特点，初步选定4种禽类病毒（包括DNA病毒和RNA病毒）编码的6种蛋白为候选蛋白，克隆这些候选蛋白基因并构建到植物表达载体pBI121中，以绿色荧光蛋白（GFP）转基因本生烟为材料，利用农杆菌瞬时表达系统鉴定其沉默抑制作用。侵染后的第3天，HVT063蛋白和NS1蛋白共侵染区都有很强的GFP表达，因此被初步确定为RNA沉默抑制子，而其余4种候选蛋白不具有沉默抑制功能。HVT063蛋白是首次鉴定的由疱疹病毒科编码的RNA沉默抑制子，本研究中的NS1蛋白来自H9N2型禽流感病毒，其沉默抑制活性也是首次被鉴定。（2）HVT063能够有效抑制局部性RNA沉默和系统性RNA沉默。HVT063与GFP共表达，其共侵染区在侵染后第3天和第6天都有较强的GFP表达，GFP mRNA的积累水平较高，而GFP siRNA几乎检测不到。将HVT063基因起始密码子ATG突变成缬氨酸密码子GTG（mHVT063），使其只能转录不能翻译，侵染后第3天时，共侵染区几乎检测不到GFP表达。说明HVT063发挥沉默抑制作用的是HVT063蛋白本身不是其mRNA。HVT063也能够抑制系统性RNA沉默。侵染后第13天时，mHVT063共侵染植株上部叶片GFP已发生沉默，而HVT063共侵染植株上部新生叶片仍然保持GFP荧光，且GFP mRNA积累水平明显高于mHVT063处理。HVT063既能有效抑制由单链RNA诱发的沉默也能抑制由dsRNA诱发的沉默，由此推测，HVT063蛋白可能作用于沉默过程中dsRNA形成的下游，通过与siRNA相结合，阻碍siRNA整合到沉默蛋白复合体RISC，或与RISC复合体中某种蛋白互作，从而抑制RNA沉默途径。（3）用病毒表达载体PVX进一步证实HVT063的沉默抑制活性，但PVX-HVT063不能逆反已建立的系统性沉默。用病毒表达载体PVX表达的HVT063也能增强共侵染区GFP的表达，显著提高GFP mRNA和PVX RNA的积累水平，而PVX-mHVT063却不具有此功能。PVX载体沉默逆反试验表明，HVT063能逆反局部性沉默，但不能逆反已建立的整株系统性沉默。推测HVT063不能阻止RNA沉默在植株内的传播，只在RNA沉默的维持阶段起作用。（4）碱性氨基酸残基在HVT063沉默抑制活性中的功能。大多数动物病毒RNA沉默抑制子是通过与dsRNA或siRNA相结合抑制RNA沉默途径。HVT063蛋白包含两个碱性氨基酸密度较高的区域——1区和2区。这些碱性氨基酸是否与RNA的结合有关从而对HVT063的沉默抑制功能起关键作用呢？我们将这两个区域中的全部11个精氨酸（R）和赖氨酸（K）分别突变成丙氨酸（A），检测RNA沉默抑制功能的变化。结果显示，11个位点的碱性氨基酸每个单突变后均减弱了HVT063的沉默抑制功能，1区中的4个碱性氨基酸其中3个（138K、139R、140R）突变后HVT063完全失去沉默抑制活性，因此推测1区可能参与了HVT063关键功能域的形成；而2区的191R和193R突变后也使HVT063完全丧失功能。以上这些氨基酸可能直接参与了HVT063与RNA的结合或与沉默抑制功能直接相关。（5）HVT063沉默抑制活性与浓度有关且高浓度HVT063抑制沉默的同时引起侵染区细胞部分坏死。为了进一步明确HVT063的沉默抑制功能、细胞致死能力与其表达量之间的关系，设置不同浓度梯度的HVT063重组质粒农杆菌进行共侵染试验，结果表明，随着重组质粒农杆菌稀释倍数的增加，其RNA沉默抑制能力及细胞致死能力都呈现下降趋势。因此，HVT063的RNA沉默抑制功能和细胞致死能力均具有剂量依赖性。（6）NS1能抑制单链RNA和双链RNA引发的局部和系统性沉默，1~70位氨基酸是沉默抑制功能的关键功能域。将NS1与已鉴定的强沉默抑制子p19的RNA沉默抑制能力进行了比较，研究表明，侵染后7到10天，NS1局部沉默抑制能力显著强于p19；其余检测时间弱于p19。NS1能抑制系统性沉默，但不能彻底阻止沉默信号的在整株内系统性传播。突变分析表明，NS1的35位和46位精氨酸突变为丙氨酸后丧失沉默抑制功能，是沉默抑制功能域的必需氨基酸；41位精氨酸突变成丙氨酸不影响抑制功能。缺失71~230位氨基酸的突变体能抑制单链RNA引起的沉默但不能抑制双链RNA引起的基因沉默，说明该突变体可能降低了NS1的沉默抑制活性或改变了其作用阶段。66~230位氨基酸的缺失会使NS1丧失沉默抑制活性，因此1~70位氨基酸序列是沉默抑制功能的必须功能域，但更强的抑制活性则需要70位以后区域的参与。