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背景肺移植是治疗晚期肺实质及肺血管疾病的唯一有效方法,近几年的发展异常迅速,无论是单、双肺移植还是心肺移植,均已获得临床成功,并且越来越受到人们的关注。成功的肺移植必然要解决供肺保存的质量问题,保存方法的优劣和保存时间的长短对肺组织的结构和功能有重要的影响。目前临床上公认的离体肺保存时间最好在4小时以内,保存方法为肺循环灌注后的单存低温保存。离体肺在保存过程中是具有活力的组织,肺组织的能量代谢仍然在进行,但其能量代谢物质来源却中断了,虽然常用肺保存方法中都有肺灌注,但仅仅局限于肺保存早期,离体肺灌注完成后,仅限于低温保存,限制了离体肺获取代谢能量,不利于较长时间的肺保存。离体肺灌注技术长期以来都是临床和实验研究的重点,国内外许多学者对逆向灌注、预处理、后期再灌注、支气管动脉再通技术进行了大量研究。目前关于离体肺损伤的研究都没有取得突破性进展,缺乏一种简便高效的保护策略,肺保存面临的问题和局限性日益突出。目的本研究通过比较动态灌注(体外循环机持续灌注与间断压力灌注)和静态保存(低温保存)对离体肺保护作用,探讨离体肺损伤的机制,阐明模拟肺循环和心脏机械灌注的优越性。方法1.将30只Mongrel犬随机分成3组,在保持机械通气的条件下,完整摘取双肺。进行体外循环机持续灌注、间断压力灌注、单存灌注离体肺循环后低温浸泡保存,并按时间点留取并保存标本。2.采用HE染色法观察犬离体肺组织病理改变,免疫组化法和蛋白质印迹法检测犬离体肺组织AQP1的表达。3.采用酶消化法分离并培养犬肺微血管内皮细胞,显微镜观察肺微血管内皮细胞的形态,免疫荧光染色鉴定肺微血管内皮细胞。4.将培养的犬肺微血管内皮细胞随机分成三组,分别为模拟体外循环组、模拟压力灌注组和模拟低温保存组,n=10。利用CCK-8法检测犬肺微血管内皮细胞活性、Transwell法检测犬肺微血管内皮细胞迁移能力、Rhodamine 123染色检测犬肺微血管内皮细胞线粒体膜电位、硝酸还原酶法定量测定各组细胞保存液NO的浓度、ELISA法定量测定各组细胞保存液ET-1的浓度以及Western blot测定各组细胞VEGF的表达量。结果1.HE染色发现,随着离体时间的延长,肺泡组织结构逐渐塌陷,炎性细胞及渗出增多,肺泡间隔也逐渐增宽,肺泡腔内可见渗出物。三组之间比较,体外循环组的肺组织结构损伤变化较轻,压力灌注组次之,低温保存组最严重。免疫组化检测AQP1结果：各实验组内0h-2h AQP1变化无差异,p>0.05,2h-8h AQP1的表达量呈下降趋势,变化显著,p<0.05；在lh-2h每个时间点上,各组间AQP1变化无差异,p>0.05,3h-8h每个时间点上,各组间AQP1变化差异显著,体外循环组AQP1蛋白的表达量高于压力灌注组,压力灌注组又高于低温保存组,p<0.05。Western blot检测AQP1结果：在各实验组内,0h-3h AQP1变化无差异,p>0.05; 3h-8h AQP1的表达量呈下降趋势,变化显著,p<0.05；在lh-3h每个时间点上,各组间AQP1变化无差异,p>0.05；在4h-8h每个时间点上,各组间AQP1变化差异显著,体外循环组AQP1蛋白的表达量高于压力灌注组,压力灌注组又高于低温保存组,p<0.05。2.酶消化法分离并培养犬肺微血管内皮细胞,此方法成功率高,费用适中,重复性较好。①各组内,0h-3h肺微血管内皮细胞活性变化不显著,p>0.05；3h-8h肺微血管内皮细胞活性随着时间的延长呈逐渐降低,p<0.05。在0h-3h的每个时间点上,各组间肺微血管内皮细胞活性变化不显著,p>0.05；但在4h-8h的每个时间点上,低温保存组细胞活性低于压力灌注组,而压力灌注组低于体外循环组,p<0.05。②各组内,0h-5h进入到微孔膜下层的细胞数目差异不显著,p>0.05；5h-8h细胞数目显著减少,p<0.05；在0h-4h每个时间点上,各组间肺微血管内皮细胞进入到微孔膜下层的细胞数目变化不显著,p>0.05；但在5h-8h每个时间点上,各组细胞数目变化显著,其中体外循环组肺微血管内皮细胞数目在每个时间点上均高于压力灌注组,而压力灌注均高于低温保存组,p<0.05。③在各组内,肺微血管内皮细胞线粒体膜电位总体趋势是逐渐下降的(0h-3h、p>0.05,3h-8h、p<0.05);在各组间,在0h-3h每个时间点上,肺微血管内皮细胞线粒体膜电位无显著变化,p>0.05,在4h-8h每个时间点,肺微血管内皮细胞线粒体膜电位呈现下降趋势,体外循环组高于压力灌注组,而压力灌注组又高于低温保存组,p<0.05。④犬肺微血管内皮细胞保存液NO的浓度在保存起始阶段呈逐渐升高的趋势,但模拟体外循环组在6小时达到高峰,而模拟压力灌注组和低温保存组在4-5小时就已达到峰值,之后各组均呈下降趋势；在0h-3h,每个时间点保存液中NO的浓度进行组间比较(p>0.05)未见明显差异,在4h-8h,体外循环组高于压力灌注组,而压力灌注组又高于低温保存组,差异显著(p<0.05)。⑤犬肺微血管内皮细胞保存液ET-1的浓度呈逐渐升高的趋势,但模拟体外循环组升高的幅度小于模拟压力灌注组和低温保存组。在0h-3h,每个时间点保存液中ET-1的浓度进行组间比较(p>0.05)未见明显差异,在4h-8h,体外循环组低于压力灌注组,而压力灌注组又低于低温保存组,差异显著(p<0.05)。⑥在每种保存方式下,VEGF在离体肺组织中的表达随着时间的延长呈逐渐上调的趋势,0h-3h差异不显著,p>0.05,在3h-8h,差异显著,p<0.05。在lh-3h各个时间点下,各组间肺微血管内皮细胞中VEGF基因的表达量无显著差异,p>0.05；而在4h-8h各个时间点下,各组间肺微血管内皮细胞中VEGF基因的表达量差异显著,低温保存组VEGF基因的表达量显著高于压力灌注组,压力灌注组又显著高于体外循环组,p<0.05。结论动态灌注对离体肺的保护作用显著优于静态保存,其中体外循环机持续灌注对离体肺的保护作用又优于间断压力灌注。